γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是脊椎动物和无脊椎动物体内重要的抑制性神经递质,它的传递作用是由GABA受体介导的。GABA大部分作用是通过GABAA受体介导的。GABAA受体不仅是治疗人的癫痫,失眠,精神分裂症,酒精中毒,帕金森综合症等神经系统疾病的医药作用靶点,而且是氟虫腈,林丹、硫丹等有机氯类,及阿维菌素类等杀虫剂的作用靶标。氟虫腈(Fipronil)是一种高效的的苯基吡唑类杀虫剂,为GABAA受体拮抗剂,通过作用于GABAA受体,阻断氯离子通道,导致神经信号的损失、过度兴奋及死亡。氟虫腈对不同生物具有毒性差异,对蝇类、鞘翅目及鳞翅目等系列害虫具有很高的杀虫活性,对哺乳动物GABAA受体具有较低的亲和力,所以对哺乳动物的毒性非常低。但氟虫腈对某些非靶标生物,如鱼类等水生生物的毒性很高,鱼类是水生生态系统中的重要组成部分,因此氟虫腈对鱼类的毒性机理研究及其重要。本论文的主要创新点为:针对氟虫腈对鱼类高毒问题,①本论文首次利用荧光探针法探索了鱼类GABAA受体与农药氟虫腈及1,4-苯二氮卓类药物RO7的相互作用;②利用计算机模拟方法研究了氟虫腈与鱼类GABAA受体的相互作用,即采用同源模建的方法构建了斑马鱼α1β2γ2型GABAA受体模型,运用分子对接考察氟虫腈(及其代谢物)与鱼类GABAA受体间的作用模式,阐明了氟虫腈产生鱼毒的机理。③利用生物模板法,合成了粒径分布1.5μm非磁性及磁性单分散二氧化硅,进一步采用反相悬浮包埋法成功制备琼脂糖-二氧化硅亲和层析载体。④利用氟虫腈和RO7作为亲和配基制成亲和层析色谱柱,采用亲和层析法初步分离了鱼类GABAA受体,探索了两种亲和柱对鱼类GABAA受体分离的条件。本论文取得的主要研究结论如下:1)1,4-苯二氮卓药物制备方面:1,4-苯二氮卓药物在脊椎动物GABAA受体研究中具有极大的重要性,本课题设计并合成了1,4-苯二氮卓药物RO7及洗脱剂氟西泮,对其合成条件进行了详细的探讨,中间产物及最终产品的结构均通过核磁共振氢谱,红外光谱、熔点仪等测试手段确证。2)荧光探针法研究1,4-苯二氮卓药物与鱼类GABAA受体相互作用方面:用异硫氰基荧光素(fitc)标记苯二氮卓化合物ro7制备了ro-fitc(rf)荧光探针,研究了该荧光探针与鱼脑内gabaa受体的相互作用,同时研究了gaba对ro7与gabaa受体之间相互作用的影响。结果显示,所制备的荧光探针rf与鱼脑内gabaa受体有特异性结合,ro7与受体的亲和解离常数kd值为67±5nmol/l,最大结合量[rt]值为13.8±1.8pmol/mgprotein。gaba能促进ro7与gabaa受体的结合。以上说明鱼类gabaa受体与哺乳动物结构和功能上相似。3)荧光探针法研究氟虫腈与鱼类gabaa受体相互作用方面:以异硫氰酸荧光素(fitc)标记氟虫腈(fipronil)制备了fipronil-fitc(ff)荧光探针,研究了该荧光探针与鱼脑内gabaa受体的相互作用。结果显示,所制备的荧光探针ff与鱼脑内gabaa受体有特异性结合,fipronil与受体的亲和解离常数kd值为346±6nmol/l,最大结合量[rt]值为40.6±3.5pmol/mgprotein。与哺乳动物相比,fipronil对鱼类和昆虫gabaa受体亲和力较高,这可能是fipronil对鱼类毒性高于哺乳动物毒性的一方面原因。4)计算机模拟技术研究氟虫腈与鱼类gabaa受体相互作用方面:为了研究氟虫腈对鱼类的毒性机理,采用计算机模拟的方法,以烟碱型乙酰胆碱受体为模板,同源建模构建了斑马鱼α1β2γ2型gabaa受体模型,通过分子对接和分子动力学模拟,考察氟虫腈(及其代谢物)与gabaa受体间的分子相互作用。发现氟虫腈与斑马鱼gabaa受体离子通道内侧的2′,6′和9′的氨基酸有强烈的结合作用,其中氟虫腈苯环及cf3位于胞内区一边,吡唑环与socf3位于胞外区一边,特别是氟虫腈与6′位亲水性氨基酸残基苏氨酸形成3条氢键,这对与氟虫腈与鱼类gabaa受体的结合非常关键,氟虫腈与鱼类gabaa受体间的强烈的氢键作用可能是氟虫腈对鱼类产生高毒的原因。同时考察了氟虫腈在环境中主要的四种代谢产物与斑马鱼gabaa受体的相互作用,对接显示四种代谢产物与受体的cdocker相互作用能均比氟虫腈低,特别是mb46136和fipronil-desulfinyl。说明氟虫腈代谢产物的对鱼类的毒性都强于氟虫腈,具有较高的环境风险。以烟碱型乙酰胆碱受体为模板,同时同源建模构建了大鼠α1β2γ2型gabaa受体模型,通过分子对接和分子动力学模拟,发现氟虫腈与大鼠gabaa受体仅形成一条氢键,而氟虫腈与斑马鱼gabaa受体6′位亲水性氨基酸残基苏氨酸形成3条氢键,以上从理论上说明了氟虫腈对鱼类高毒而对哺乳动物低毒的原因。5)亲和层析载体制备方面:利用生物模板法,合成了粒径分布1.5μm的单分散性的二氧化硅、实心磁性二氧化硅及空心磁性二氧化硅,并采用反相悬浮包埋法成功制备琼脂糖-二氧化硅复合粒子。利用四亚甲基乙二醇缩水甘油醚作为环氧活化剂,用于活化琼脂糖-二氧化硅复合粒子,最终确定了环氧活化剂活化介质的最佳反应条件,最终得到介质的环氧基密度达65.3μmol/g胶,为成功制备分离鱼类GABAA受体的亲和介质奠定了基础。6)去污剂对鱼类GABAA受体溶出效率方面:在对鱼类GABAA受体分离时,比较了4%CHAPS,2%Sodium Deoxycholate,2%OCTG,1%Triton X-100,1%Nonidet P-40及0.5%Lubrol-PX等六种去污剂对GABAA受体蛋白溶出量,结果显示1%Nonidet P-40对受体蛋白溶出量最高,为729μg/m L。7)亲和层析柱的制备及鱼类GABAA受体分离方面:分别以氟虫腈和1,4-苯二氮卓化合物RO7为亲和配基,琼脂糖-二氧化硅复合粒子为载体,制备了两种亲和柱;比较了两种亲和柱分离鱼类GABAA受体亚基的区别,其中经RO7亲和柱可分离出4条条带,分子量分别为56,54,43及37 kD,而氟虫腈亲和柱仅分离出分子量分别为44 kD和55 kD两条条带,初步证明苯二氮卓类化合物RO7与氟虫腈作用于GABAA受体的不同亚基,这是造成氟虫腈对鱼类产生毒性的原因。