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目的1.通过加入细胞因子GM-CSF、IL-4体外联合诱导方法成功培养分离出小鼠骨髓源树突状细胞(DCs),用于体外实验研究。2.对培养出的细胞从形态学观察、细胞表面分子检测两方面鉴定树突状细胞纯度,为后续实验研究提供实验基础。3.以痛风细胞模型为研究对象,给予中药土茯苓总黄酮(TFSG),通过对痛风关键因子IL-1β、TNF-α以及相关蛋白Caspase-1的研究,初步评价土茯苓总黄酮的抗痛风作用,为进一步研究TFSG抗痛风的作用机制提供基础。方法1、细胞培养:颈椎脱位法处死小鼠,无菌取股骨,冲洗出骨髓细胞,以1×106细胞/孔加入6孔板在RPMI1640完全培养基中培养,在胎牛血清(FBS)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)、rmIL-4中分化7天,制备小鼠骨髓细胞来源的树突状细胞(BMDCs)。2、小鼠骨髓源树突状细胞鉴定:2.1倒置显微镜下对DCs形态观察。2.2流式细胞仪检测CD86细胞表面分子:收集细胞培养板中的悬浮细胞,经离心、洗涤、计数、定容、标记后分别加入抗体和同型对照组IgG,室温避光孵育20分钟后离心、洗涤后使用流式细胞仪检测DCs表面CD86的表达情况。3、确定TFSG作用于小鼠DCs的安全浓度范围:采用MTT法研究不同浓度土茯苓总黄酮对小鼠DCs的生长情况,约5×103个/孔细胞接种于96孔板,分别加入不同浓度TFSG后,在培养箱中分别孵育24h,48h,72h,结束后分别加入MTT溶液,继续避光孵育3h(待紫色晶体形成),再加入DMSO溶液溶解晶体,最后在酶标仪上(570nm波长)检测各孔OD值。4、土茯苓总黄酮干预作用:将DCs(1×106cells/ml)分为6组,即正常组、模型组、秋水仙碱组、土茯苓总黄酮组(低、中、高剂量组),除正常组外,然后加入尿酸钠(MSU)晶体(100μg/ml)在与一定体积土茯苓总黄酮(100、300、500μg/ml)或阳性对照药秋水仙碱(0.1μg/ml)混合后,37℃共同孵育20h。正常组、模型组用培养液代替药物,试验均重复3次,最后,收集上清液用ELISA法测定细胞因子IL-1β、TNF-α水平,通过Western blot法检测Caspase-1表达水平。结果1、倒置荧光显微镜观察:小鼠骨髓细胞培养24h后去上清,再经rmGM-CSF、rmIL-4诱导培养48h,此时大部分细胞贴壁生长,细胞形态不规则,有集落形成,培养72 h后悬浮细胞增多,集落增多。培养第6天可见悬浮细胞更多,有少量树突样突起。加入LPS培养24h后细胞表面出现典型树突样突起,符合DCs形态。2、流式细胞仪检测DCs表面分子:第4d,6d小鼠骨髓源成熟树突状细胞对细胞表面CD86表达出现很大变化,第6d细胞表面CD86阳性率增加到32.5%,查阅文献,符合DCs的表达特征。3、通过ELISA法测得,与正常组相比,模型组上清液中IL-1β、TNF-α水平升高,与模型组相比,较高剂量TFSG使IL-1β、TNF-α水平下降;通过Western blot检测得发现,模型组Caspase-1的相对表达水平升高,较高浓度TFSG组中Caspase-1的相对表达水平降低。结论1、本实验利用GM-CSF、IL-4及LPS体外诱导培养的方法成功培养并扩增出符合实验要求的DCs,具有典型的树突状突起。2、较高浓度TFSG对痛风中的主要因子IL-1β、TNF-α有一定的影响,相关蛋白Caspase-1的相对表达水平下调,可初步评价TFSG对痛风有一定的治疗作用。