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线粒体基因组具有种内高度保守性,同时具有很强的抗腐蚀性,其上的12S rRNA基因更具抗腐蚀、耐高温的特点,在国内外被逐渐用于饲料、鲜肉及肉制品的来源追踪和物种成分鉴别等研究。本研究用牦牛、黄牛、水牛作为研究材料,根据食品加工特点,把样品分为新鲜样品和加工模拟组样品。加工模拟组样品进行温度梯度处理(100℃、120℃、140℃、160℃、180℃)研究不同温度下对鉴别的影响。针对不同的样品处理方式采取相应的DNA提取方法提取DNA。对部分新鲜样品组DNA采用连续稀释的办法,使DNA浓度达到相当于实际样品含量的1%,0.1%,0.01%,0.001%,确定鉴别的最低DNA模板浓度。设计引物P1扩增真核生物共有的137bp长度的18S rDNA基因片段作为内源参照验证加工样品提取DNA模板质量的有效性;设计通用引物P2扩增牦牛、黄牛、水牛线粒体12S rRNA基因片段,扩增片段大小为453 bp(黄牛452 bp),在扩增片段区域寻找牦牛、黄牛、水牛各自不同的特异的酶切位点。通过测序验证酶切位点的正确性。建立了鉴别牦牛、黄牛、水牛的PCR-RFLP分析方法,可用于混合鲜牛肉及制品的牛种来源的鉴别。对分别来自四川、甘肃、云南、陕西、安徽、广东、湖北的2个牦牛品种,8个黄牛品种,4个水牛品种,每个品种采集肌肉样30个,共420个,用该方法分别进行鉴别分析,设计的引物均能扩增出相应PCR产物。对扩增产物用BspHⅠ、EcoNⅠ、HpaⅡ进行酶切,并进行测序验证,结果如下:牦牛12S rRNA基因片段被酶切为203 bp和250 bp,黄牛12S rRNA基因片段被酶切为134 bp和318 bp,水牛12S rRNA基因片段被酶切为86 bp和367 bp,没有交叉酶切现象,通过测序验证了特异性位点和酶切的正确性。经过对样品经过不同温度处理(100℃、120℃、140℃、160℃、180℃)后发现在不同温度处理下均能扩增目的条带,但条带从120℃开始变淡。在优化PCR反应条件情况下,DNA模板浓度在0.01%时,牦牛12S rRNA基因片段酶切条带几乎不可见,得出酶切鉴别的最低DNA模板浓度要求为0.01%。用本研究建立的方法对分别购自雅安、康定、成都超市的24个品牌的牦牛肉干制品进行鉴别,发现仅有3个品牌是牦牛肉,剩余的其中6个品牌是黄牛制品,4个品牌是水牛制品。除此之外的为其它的肉制品。说明牛肉干市场上用黄牛、水牛甚至其它的肉冒充牦牛干制品的现象非常严重。本研究建立的方法是国内首创的可以快速检测牛肉制品中的牦牛、黄牛、水牛成分,可作为检测牛肉制品中牦牛、黄牛、水牛的精确检测手段。