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植物茎髓腔(pithcavity)是茎节间中空部分,是植物茎内中央基本组织细胞或髓细胞在茎生长过程中逐渐降解而形成的空腔。髓腔在水生植物种类中普遍存在,在陆生植物种类中也较常见,如小麦、水稻、竹等植物中。髓腔的形成是髓细胞死亡而引起的,在水生植物中主要作为气体交换的通道,在陆生植物中可减少植物体生长过程中营养物质的消耗,另外空心结构的发生有助于茎具有柔韧性,使植物不易折断或倒伏,确保能更好地支撑植物体地上部分。细胞程序性死亡(PCD)是植物生命活动中重要的细胞学事件,在植物体的生长发育过程中,PCD贯穿于植物生活史的全过程,在植物形态建成、生长发育、有性生殖及相应环境胁迫等过程中发挥着重要作用。为探讨植物茎髓腔发生的PCD过程,本研究以禾本科植物水稻和小麦为研究对象,选取幼茎不同发育阶段的实心期(Stage1,S1)、空腔出现期(Stage2,S2)、空腔扩大期(Stage3,S3)和髓腔成熟期(Stage4,S4)四个时期的髓组织,通过光学显微镜、荧光显微镜和电子显微镜在细胞学上研究髓细胞死亡过程中细胞核、液泡、线粒体、细胞膜及细胞壁等细胞结构的变化,分析探讨髓细胞死亡的特征。研究结果表明两种植物在髓细胞死亡过程中具有相似的特征。在茎发育早期,髓细胞体积较小,排列紧密,无胞间隙,细胞核大,位于细胞中央,细胞质浓,细胞核和主要细胞器线粒体结构完整,被膜清晰;此时细胞中几乎没有液泡;细胞膜和细胞壁结构整齐。随着茎的发育,髓细胞体积增大,细胞中出现了许多小液泡,随后相互融合形成中央大液泡。同时,液泡在液泡膜多处以内陷方式吞入细胞质基质和部分线粒体等细胞器,被液泡膜包裹的这些小体在液泡水解酶的作用下发生降解。此时细胞核固缩,染色质凝集,核被膜破裂;被液泡挤向边缘的细胞器也开始发生降解,线粒体肿胀,进一步被膜破裂;细胞膜与细胞壁发生分离,细胞膜在多处向胞质内折,同时观察到大量泡状结构存在,细胞壁最后发生降解,是髓细胞死亡的最后事件。通过荧光显微镜观察,DAPI染色和TUNEL检测结果显示在茎发育早期阶段,髓细胞核呈圆形,形态规则,DAPI染色均匀,TUNEL检测为阴性;随着茎的发育,髓组织中出现空腔并进一步扩大,DAPI染色显示细胞核结构畸形,染色不均匀,TUNEL检测为阳性。以上研究结果表明髓腔在发生时髓细胞的死亡是典型的PCD过程。为进一步探讨髓细胞发生PCD的具体机制,对小麦幼茎不同发育时期的髓组织进行了转录组测序,追踪与细胞程序性死亡相关的基因,对四个不同发育时期样本和相关基因表达间的关系进行层级聚类,使用热图呈现聚类结果。结果表明大部分与PCD相关的基因在空腔出现期和空腔扩大期表达水平上调,有的基因在实心期就开始发生表达上调;而在髓腔成熟期时,这些相关基因几乎都发生了表达水平下调,这说明在髓腔成熟期,细胞不再发生PCD事件。将这些与PCD相关的基因按功能进行归类,通过qRT-PCR对其表达水平进行检测验证,结果表明qRT-PCR检测结果与转录组测序结果相互吻合。通过转录组测序发现ACC合成酶(ACS)基因ACS的表达水平在实心期就显著上调,这与乙烯合成途径中ACS是乙烯合成上游途径的关健酶相关,而乙烯合成的关健限速酶ACC氧化酶(ACO)基因ACO的表达在时间和空间上相对滞后,在空腔出现期表达量达到最大。通过免疫印迹对ACO进行定位发现该酶在空腔出现期含量最高,该结果与转录组测序结果和qRT-PCR验证相互一致,进一步说明乙烯作为作为信号分子参与了髓腔发生的PCD过程。钙调蛋白基因(CAM)和钙网蛋白基因(CRT)基因在实心期和空腔出现期相对表达量较高,说明钙离子作为信号分子也参与了PCD过程。ACS、ACO、CAM和CRT基因在实心期及空腔出现期相对表达量较高,说明在茎发育过程中钙离子和乙烯作为上游信号分子共同参与了髓细胞的PCD过程。与活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS)相关的基因中,过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和谷胱甘肽S转移酶(GST)基因在空腔出现期和扩大期相对表达量较高,说明在髓腔形成的PCD过程中,细胞内了产生了大量ROS。纤维素酶基因(CELLULASE)在空腔扩大期相对表达量最高,这和髓细胞PCD中细胞壁最后降解事件相互吻合。另外线粒体中凋亡诱导因子基因(Apoptosis-InducingFactor,AIF)、细胞色素c氧化酶亚基6B基因(CytochromecOxidaseSubunit6B,COX6B)和交替氧化酶基因(AlternativeOxidase1a,AOX1a)及核酸内切酶基因(BIFUNCTIONALNUCLEASE1,BFN1)和核糖核酸酶基因(RIBONUCLEASE3,RNS3)均参与了髓细胞的PCD。半胱氨酸蛋白酶基因PBA1和凋亡蛋白酶激活因子1基因(Apoptoticproteaseactivatingfactor-1,Apaf-1)在实心期就大量表达,这可能与髓细胞在发育早期已决定发生PCD的命运相关。通过DNA凝胶电泳对不同发育时期髓组织核DNA进行研究,发现两种植物均在空腔出现期和扩大期呈现DNA条带显著的拖尾现象,说明在这两个时期DNA均发生了降解,进一步证明髓细胞的死亡是典型的PCD过程。Caspase3-like免疫组化结果表明Caspase3-like在髓腔发育早期位于细胞核中,可能与染色质浓缩和DNA片段化紧密相关;免疫印迹发现Caspase3-like在空腔出现期和扩大期的髓细胞中含量居高,说明Caspase3-like在髓腔发生的PCD过程中发挥着重要作用。通过罗丹明123(Rh123)对不同发育时期线粒体进行染色,发现在空腔出现期和扩大期时线粒体荧光强度降低,说明这两个时期线粒体膜结构破坏,这与电镜下所观察的线粒体在空腔出现期体积肿胀,膜结构破坏的结果相互一致。通过免疫组化、免疫印迹、免疫荧光和免疫胶体金电镜技术分别对线粒体中细胞色素c(Cytochromec,Cytoc)进行了定位研究。免疫组化结果表明:在空腔出现期和扩大期,Cytoc在细胞质中呈阳性反应。对线粒体提取液及线粒体提取后的细胞质基质进行蛋白免疫印迹,结果表明在空腔出现期和扩大期中,线粒体提取液中Cytoc含量很少。与其相反的是,在这两个时期细胞质基质中有大量Cytoc存在,说明Cytoc在这两个时期已从线粒体释放至细胞质基质。通过免疫胶体金电镜技术进一步对Cytoc的空间位移进行了定位,发现Cytoc金颗粒在茎发育早期主要存在线粒体中,随着茎的发育,Cytoc金颗粒从线粒体释放至细胞质基质中。通过以上不同方法所得的结果均说明在髓腔形成过程中,Cytoc随着线粒体被膜的破裂,从线粒体中释放至细胞质基质,该研究表明线粒体和Cytoc在小麦茎髓细胞PCD过程中发挥了重要作用。