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【目的】构建oxyntomodulin基因的双歧杆菌表达载体,并用此表达载体转化长双歧杆菌,观察目的蛋白oxyntomodulin在双歧杆菌内的表达及其对小鼠摄食量和体重的影响。【方法】以长双歧杆菌的基因组DNA为模板扩增复制子和多聚酶基因序列。PCR扩增来源于双歧杆菌的信号肽基因,保留克隆质粒pBAD-A的氨苄抗性基因和启动子基因,在多克隆位点Bst1107上插入双歧杆菌质粒复制子及聚合酶序列(BLP),并用来源于双歧杆菌的信号肽序列取代原质粒pBAD-A中基因Ⅲ序列。在BpiI和XbaI之间插入报告基因GFP基因序列(GFP)。BpiI和XbaI双酶切除大肠杆菌一双歧杆菌穿梭表达质粒载体pBADs-GFP中GFP基因序列,酶切产物与OXM目的片段进行连接反应,获得含OXM目的片段的大肠杆菌—双歧杆菌穿梭表达质粒载体PBBADs-OXM。以电穿孔法将此表达载体PBBADs-OXM转化B.longum NCC2705,于氨苄阳性MRS培养基中,37℃厌氧培养。做革兰氏染色,显微镜下观察转化后B.longumNCC2705形态。以转化后B.longum基因组DNA为模板,PCR扩增16s片段。以此双歧杆菌质粒为模板,扩增OXM片段。以终浓度为0.2%的阿拉伯糖诱导培养PBBADs-OXM转化的B.longum,于0、12、24、48小时分别留取菌体和菌液。提取菌体中蛋白。ELISA检测培养上清中OXM,以50ug总蛋白WESTERNBLOT。取断乳昆明小鼠,随机取8只小鼠给予正常饮食,其余小鼠给予高脂饮食,构建肥胖小鼠模型。取肥胖小鼠32只,随机分为模型组,阴性对照组,OXM组,阳性对照组,每组8只小鼠。阴性对照组小鼠给予阿拉伯糖(终浓度0.2%)诱导的B.longum NCC2705菌液0.9ml灌胃,OXM组小鼠,给予阿拉伯糖诱导的PBBADs-OXM转化B.longum菌液0.9ml灌胃,阳性对照组小鼠,给予赛尼可1g/kg灌胃,计各组小鼠每天食物摄取量,每周称量体重。30天后处死动物,检测血浆甘油三酯水平。另取2月龄昆明小鼠36只,随机分为3组,正常组给与生理盐水0.9ml灌胃;阴性对照组给与阿拉伯糖诱导后的B.longum NCC2705菌液0.9ml灌胃,OXM组给与阿拉伯糖诱导后的PBBADs-OXM转化双歧杆菌菌液0.9ml灌胃;每日下午,3组均给与13C标记的棕榈酸,六天后,处死动物。酶联免疫法检测小鼠血清中oxyntomodulin和Ghrelin表达浓度。质谱法检测13C/总碳比,观察各组小鼠脂肪代谢。【结果】未携带来源于双歧杆菌质粒的复制子和聚合酶序列BLP的对照质粒pBS-GFP转化菌不能形成菌落,而携带BLP序列的重组质粒有菌落形成,并且此菌落中细菌保留了长型双歧杆菌的典型形态。PCR扩增在800bp和100bp处见条带出现。分别代表16s和OXM基因片段的形成。酶联免疫吸附试验结果显示Oxyntomodulin在PBBADs-OXM转化的B.longum NCC2705培养液上清和菌体沉淀中均有表达,且上清的表达水平高于菌体沉淀中的水平。WESTERNBLOTING显示:转化双歧杆菌在0.2%阿拉伯糖诱导后,在4KD-5KD之间可见蛋白表达条带。酶联免疫吸附试验结果显示Oxyntomodulin在PBBADs-OXM转化的B.longum NCC2705培养液上清和菌体沉淀中均有表达,且上清的表达水平高于菌体沉淀中的水平。动物实验观察到:经过口服阿拉伯糖诱导的pBBADs-OXM转化双歧杆菌菌液或赛尼可后,肥胖小鼠的食物摄取量与模型组小鼠比较显著减少。OXM组小鼠食量达正常小鼠水平。体重比较结果显示模型组小鼠体重显著高于正常组(P＜0.05),经过灌饲阿拉伯糖诱导的pBBADs-OXM转化双歧杆菌菌液,肥胖小鼠体重下降,显著低于模型组。而长双歧杆菌B.longumNCC2705处理的小鼠其体重下降不显著,体重与模型组无差异(P＞0.05)。血浆甘油三酯检测结果:正常组血浆血脂:1.957±0.238mmol/L;模型组:5.468±0.759mmol/L;阴性对照组:2.021±0.177 mmol/L;OXM组:1.661±0.137 mmol/L;阳性对照组:1.692±0.486 mmol/L。模型组血浆甘油三酯显著高于正常组,OXM组甘油三酯水平显著低于模型组(P＜0.05)。ELISA方法检测显示小鼠血清中OXM水平分别为:NS组,36.183±3.876pg/mL;阴性对照组,38.233±4.139pg/mL;OXM组,37.044±4.870 pg/mL,无统计学差异(P＞0.05)。各组小鼠血清中Ghrelin均值分别为:NS组,23.680±3.639pg/mL;阴性对照组32.145±1.571pg/mL;OXM组12.277±.580pg/mL。OXM组血清中Ghrelin与阴性对照组有统计学差异(P＜0.05)质谱分析各组13C/总碳比比值分别为:NS组:-20.033±0.056;OXM组:-21.191±0.043;阴性对照组:-21.225±0.049。各组之间无差异。【结论】克隆了人oxyntomodulin基因,构建了含该基因的穿梭质粒载体,筛选出了含有oxyntomodulin的转基因双歧杆菌。转基因双歧杆菌在体外经过诱导可以表达目的蛋白。转基因双歧杆菌能在体内表达oxyntomodulin,并发挥减轻体重,降低血浆甘油三酯的作用。OXM转化长双歧杆菌对肥胖小鼠脂肪代谢未见显著影响。