肿瘤的发生与细胞凋亡的失衡有密切关系。c-FLIP是一种重要的凋亡抑制蛋白,在大部分肿瘤细胞株(如黑色素瘤、结肠癌、胰腺癌、骨肉瘤、前列腺癌、卵巢癌等)中高表达。结构上,c-FLIP(L)是凋亡执行酶caspase8的类似物,但缺少caspase-8的酶活性,在细胞凋亡通路中通过DEDs结构域与procaspase-8竞争性结合上游的FADD蛋白,从而抑制死亡受体(death receptors)介导的细胞凋亡过程。c-FLIP(L)不仅在细胞凋亡过程中起作用,还发现它参与细胞增殖并且促进肿瘤的发生发展。在多种肿瘤细胞中都发现c-FLIP(L)高表达,它能够与TRAF2及Raf等相互作用参与ERK,NF-κB等途径影响与肿瘤细胞的增殖和转移相关的基因的表达,深入了解c-FLIP在肿瘤形成中的作用及其分子机制对于肿瘤形成机制的理解,肿瘤的预防及治疗都具有重要的意义。Wnt信号通路是一个复杂的蛋白质网络,其功能常见于胚胎发育和肿瘤的发生。已有研究表明,c-FLIP(L)通过抑制β-catenin的泛素化降解使β-catenin在细胞质稳定存在,然后进入细胞核与TCF/LEF形成转录复合物定位到特定的结合位点,促进下游基因的转录,最终增强Wnt信号通路。另外,c-FLIP(L)可以定位到细胞核内对Wnt信号起到调控作用。c-FLIP(L)的C末端核定位信号(NLS)的突变或在N末端添加出核信号(NES)后与野生型类似都可以抑制凋亡通路和p-catenin的泛素化降解,但无法调节Wnt信号途径。从已报道的实验结果可以看出,c-FLIP(L)的进核对于调控Wnt通路过程是至关重要的。为了寻找c-FLIP(L)进入细胞核参与调控Wnt信号通路的机理,我们利用c-FLIP(L)为诱饵蛋白,通过酵母双杂交的方法对文库进行筛选成功得到了一些与c-FLIP(L)有相互作用的核内蛋白,TIP49是其中的一个。接着,我们进一步利用免疫共沉淀的方法验证它们之间的作用,并构建了c-FLIP(L)的不同结构域变体,结果显示c-FLIP(L)的DEDs结构域在与TIP49相互作用中是必须的。接着,为了阐明TIP49在c-FLIP(L)进入细胞核参与调控Wnt信号的过程中的重要作用。我们采用了特异性针对TIP49的siRNA,通过下调TIP49的表达水平下降然后检测c-FLIP(L)对Wnt信号途经的影响,说明c-FLIP(L)调节Wnt信号通路是依赖于TIP49蛋白的作用。既然c-FLIP(L)与TIP49在细胞核内有相互作用,并且在调控Wnt通路中不可或缺,那么这两个蛋白是以什么样的方式调控Wnt通路?我们通过Ch-IP(Chromatin Immuneprcipitation)实验技术确定了它们存在于β-catenin转录复合物中参与下游靶基因的表达调控,而且c-FLIP(L)促进了TIP49与β-catenin转录复合物结合位点的结合强度。最后,我们构建了c-FLIP(L)稳定表达的A549肿瘤细胞株,与对照组相比增殖明显较快,同时通过Westernblot检测了CyclinD1的表达水平,证实c-FLIP(L)通过增强Wnt信号通路来提高CyclinD1的表达水平,进而加快细胞周期的进程,促使肿瘤细胞增殖。因此,我们发现了核蛋白TIP49与c-FLIP(L)相互作用并参与调控Wnt信号通路,这些发现帮助我们更好地了解Wnt信号通路调控过程,并且为c-FLIP(L)促进肿瘤细胞的增殖提供了新的解释,为设计或筛选针对c-FLIP(L)靶点的药物提供了坚实的理论基础。