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从四川某酒厂采集的酒糟和酒糟浸出液为样本中筛选得到一株对多种革兰氏阳性指示菌、革兰氏阴性指示菌及部分霉菌具有广谱抗菌活性的类细菌素产生菌,菌株编号LL18-4。经形态观察及生理生化实验和16S rDNA PCR扩增和序列测定,鉴定该菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。
由于游离发酵等传统的微生物发酵法存在着局限性,近20年来固定化技术已经得到广泛的关注,固定化方法具有菌体密度高,反应快,抗干扰能力强,可缩短发酵周期,提高转化率,节省人力、物力以及产物分离方便,菌体可重复连续使用的优点。本文以海藻酸钙为材料,固定枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)LL18-4,研究不同的固定化小球制备对类细菌素效价的影响。结果表明,利用3%海藻酸钠在2%CaCl<,2>条件下,得到固定化细胞颗粒的类细菌素效价和稳定性较好,可维持216h无破裂。
通过单因素法对其固定化菌进行发酵条件的研究发现,当培养温度为37℃,pH值6.5,接种量1%,培养时间72h静止培养后,固定菌所产类细菌素的抑菌活性高,最高效价能达到334.2U/mL。
对固定化枯草芽孢杆菌LL18-4进行半连续培养的研究,结果表明通过216h三批次循环的半连续培养,固定菌活性能维持在260.9 U/mL 以上。对该类细菌素生物学特性进行初步研究,用蛋白酶K、溶菌酶处理发酵上清液后,该类细菌素对蛋白酶K部分敏感,对溶菌酶不敏感;经高温处理一定时间后抑菌活性保持较完整,证明其热稳定性较高;抑菌活性pH范围是4.5-8.5。对固定化菌所产类细菌素进行了抗菌谱分析,实验表明该类细菌素对大多数植物病原真菌、多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有较好抑菌作用。经过对固定化菌发酵上清液进行了盐析、透析和Sephadex G-100柱层析后发现,该抑菌活性的主要成分为蛋白类物质。
经本文研究发现,应用固定化方法生产类细菌素发酵结果好,显示了良好的应用潜力,所产类细菌素具有成为天然防腐剂的潜能。