犬瘟热病毒的分离及主要蛋白基因序列分析

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犬瘟热(Caninedistemper,CD)的病原是犬瘟热病毒(CaninedistempervirusCDV),该病以双相热、急性鼻卡他、结膜炎、严重的胃肠炎和神经症状为特征。发病率和死亡率较高,给养犬业和毛皮动物饲养业带来极大的危害,加强本病的预防免疫极为重要,因此采用重组DNA技术生产基因工程疫苗有重要意义。本文成功分离了一株犬瘟热病毒并进行了主要蛋白基因序列分析,为构建新型基因工程疫苗奠定基础。   本文通过对从2009-2011年山东部分地区疑似犬瘟热的犬、貉、貂和狐狸临床症状和病理变化进行研究,探讨犬瘟热的临床症状和病变特点,并进行流行病学调查。研究发现近几年患病犬、貉、貂和狐狸临床症状出现新的变化,足垫的角质化、皮肤病变现象逐渐减少,后肢瘫痪症状增多。广泛性出血,缺乏特征性病变。发病急、死亡率高。一年四季都有发生。   采用Vero细胞从临床疑似患犬瘟热的犬组织病料中分离出一株病毒,通过观察细胞病变,间接免疫荧光,提取细胞培养物RNA并扩增克隆分析N蛋白基因部分序列进行了鉴定。结果表明:该毒株接种于Vero细胞后,出现了典型的细胞病变;间接免疫荧光试验表明接种病毒的BHK-21细胞出现特异性的亮绿色荧光,而正常细胞则未见绿色荧光;对接种病料后的Vero细胞培养物提取总RNA进行RT-PCR扩增,得到了287bp的目的片段;序列分析表明该分离株与犬瘟热病毒弱毒(Onderstepoort、CDV3、recombinantSnyderHill等)的同源性较低为95.8%-97.2%,与标准强毒株(A75/17和2544/Han95)以及野毒株(xJ-4、ZJ7、98-2646等)的同源性较高为97.6%-99.3%,证明该毒株为犬瘟热病毒野毒株,命名为SD10。   根据Genbank上已发表犬瘟热病毒Onderstepoort(AF305419)株设计引物,参考有关文献合成9对引物,应用RT-PCR技术,从CDV分离株SD10株的细胞毒中成功扩增出了9段cDNA,将这9段cDNA与pGEM-Teasy载体连接并进行克隆、测序,测得的序列经过拼接得到CDV核衣壳蛋白基因N、磷蛋白基因P、基质膜蛋白基因M、融合蛋白基因F、血凝素蛋白基因H、大蛋白基因L的全基因序列。将分离株SD10株与22株Genbank上发表的CDV全基因组参考毒株的6个蛋白全基因核苷酸序列及推导氨基酸序列进行比较分析。分析表明分离株SD10株与疫苗株Onderstepoort(OP)和CDV3亲缘关系最远,属于强毒株,与中国分离株HLJ1-06、HIJ2-07、MKY-KM08的亲缘关系最近,同属于Asia-1基因型。
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