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目的：糖尿病影响骨代谢，诱发糖尿病性骨病。胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate1, IRS1）是胰岛素信号转导通路中受体后水平的重要信号蛋白。研究发现IRS1不仅促进骨形成，而且影响骨吸收，IRS1主要作用于成骨细胞影响骨转换，但机制尚不完全清楚。抑制成骨细胞NFκB（nuclear factor kappa-B，NFκB）通路增强成骨细胞分化、矿化和骨形成，但直接调节成骨细胞NFκB的基因仍需确定。高糖环境导致凋亡蛋白BAX（Bcl2–associated X protein，BAX）表达增加。研究发现IRS1具有抗凋亡能力，但IRS1如何调控成骨细胞BAX尚不清楚。糖尿病影响骨代谢，诱发糖尿病性骨病。1型糖尿病病人骨密度降低，2型糖尿病病人骨密度正常、升高或降低。试验证据清楚表明无论1型还是2型糖尿病病人骨折风险性均增加。糖尿病病人骨折风险性增加与成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收不平衡相关。多种机制参与糖尿病性骨病的发生。胰岛素和IGF1信号通路在糖尿病发挥重要作用，且与骨代谢密切相关。研究报导糖尿病病人骨量和胰岛素剂量、尿C肽呈正相关，外源性和内源性胰岛素可能影响糖尿病病人骨代谢平衡。胰岛素和IGF1通过经典细胞内信号转导途径影响骨代谢，下游IRS1/2、Akt（Protein Kinase B，Akt）和MEK（MAPK/ERK kinase，MEK）作用机制尚不清楚。除经典途径外，胰岛素和IGF1可能通过成骨细胞Wnt （wingless-int）和BMP2（bone morphogenic protein2）通路促进骨骼发育。胰岛素直接影响成骨细胞代谢。体外研究发现生理剂量胰岛素促进成骨细胞增殖、胶原合成、碱性磷酸酶产生，目前仍不完全清楚胰岛素促进骨形成机制。胰岛素促进成骨细胞发育和骨钙素表达，骨钙素参与骨矿化和钙离子的动态平衡。IGF1通过自分泌和旁分泌方式促进成骨细胞样细胞增殖、分化和细胞外基质产生，促进骨形成。青春期时期，IGF1决定长骨生长、骨骼发育和骨量增加，成年阶段维持骨量。IGF1增加成骨细胞数目和活性以增加骨形成；抑制破骨细胞分化以减少骨吸收。IRS1是胰岛素和IGF1信号通路重要靶分子，且对维持正常骨代谢有重要意义。IRS1基因敲除小鼠骨形成和骨吸收均减少。IRS1基因自发性突变影响成年后骨骼表型，表现为高胰岛素血症及低骨密度等。IRS1基因敲除小鼠骨折难愈合提示IRS1参与骨修复，而且其作用不能被IRS其他亚型和IGF通路替代。IRS1缺陷小鼠骨愈合受损，这种受损在IRS1重新表达后恢复。IRS1主要经成骨细胞调节骨转换，其中机制仍不完全清楚。大量体外研究已证明IGF1和IRS/PI3K/Akt通路促进成骨细胞骨分化。抑制IRS1减少成骨细胞寿命、增殖、矿化和分化。IRS1通过促进前成骨细胞增殖和分化增加骨形成，产生更多胶原增加骨基质；IRS1不仅促进骨形成和矿化，也经由MMPs（matrix metallopeptidases，MMPs）和RANKL/TNFRSF11B（tumor necrosis factor receptor superfamily, member11b）比率影响骨吸收，最终调节骨循环。此外，予以IRS1干扰RNA抑制RUNX2（runt-related transcription factor2, RUNX2）、 ALP（alkaline phosphatase, ALP）和BSP（bone sialoprotein, BSP）表达。PI3K/Akt通路与骨代谢关系密切。越来越多证据表明许多信号分子在骨发挥其特异性效应通过选择性激活成骨细胞PI3K/Akt通路。此外PI3K/Akt可以与其他信号通路和基因调控网络共同调控骨细胞发育，也有证据表明PI3K/Akt信号通路失控可能与某些骨骼病变相关。激活PI3K/Akt通路促进成骨细胞增殖。高糖诱导的氧化应激激活PI3K/Akt通路抑制成骨分化。破骨细胞产生趋化因子SIP （Sphingosine-1-Phosphate，S1P）激活PI3K/Akt信号通路，导致成骨细胞分化标记物包括碱性磷酸酶表达上调，并促进成骨细胞迁移。破骨细胞分泌骨吸收介质通过PI3K/Akt信号通路促进成骨细胞前体细胞分化和钙化。HGF（Hepatocyte growth factor，HGF）激活PI3K/Akt信号通路，增加骨桥蛋白（Osteopontin, OPN）表达调控骨矿化。在成骨细胞和钙化血管平滑肌细胞，Xie H等发现omentin1激活PI3K/Akt信号通路激活OPG和抑制RANKL产生，减轻OPG/小鼠动脉钙化和骨质流失。Akt磷酸化抑制糖皮质激素诱导的成骨细胞凋亡。胰岛素依赖型糖尿病通过抑制Akt，减弱骨形成。激活Akt，增加破骨细胞形成和增强破骨细胞分化。Akt蛋白家族有3个亚型：Akt1,Akt2和Akt3。Akt1和Akt2均在成骨细胞和破骨细胞大量表达，除了Akt3。虽然Akt蛋白单亚型敲除小鼠表现出温和的表型，但是Akt1和Akt2都敲除小鼠出现严重骨骼发育受损和侏儒症。Akt1促进成骨细胞和破骨细胞分化和存活，Akt1缺陷抑制成骨细胞RANKL表达，引起破骨细胞自主功能障碍，损害骨吸收功能。Akt1和Akt2都敲除下调RANKL诱导的NFκB p50的DNA结合能力，抑制破骨细胞分化。NFκB与骨代谢密切相关。由RANKL（nuclear factor kB ligand，RANKL）、肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF）或者白介素1（interleukin1，IL1）激活的NFκB信号通路能够诱导破骨分化基因表达，延长破骨细胞寿命，增加骨吸收。成骨细胞NFκB活性降低时，JNK活性增强，导致骨形成增强。抑制NFκB通路可以逆转TNFα抑制的成骨细胞分化。Julien M等发现在成熟成骨细胞NFκB通过一系列信号转导抑制成骨细胞矿化。体外抑制成骨细胞NFκB信号通路，增强了成骨细胞矿化，但是破骨细胞数量没有改变。NFκB激活导致成骨细胞释放IL6，成骨细胞释放IL6导致破骨细胞激活。但直接调节成骨细胞NFκB的基因仍需确定。研究发现凋亡可能是骨质疏松症第三大常见原因，估计6080%成骨细胞正处于凋亡。成骨细胞凋亡增加松质骨生成。Bcl2（B-cell lymphoma2, Bcl2）家族长久以来被认为是凋亡主要调节机制，其中Bcl2抑制凋亡，BAX促进凋亡，二者独立调节凋亡。研究发现糖尿病大鼠凋亡显著增加。糖尿病时，高糖环境引起细胞损伤，BAX激活和引起其他促凋亡蛋白如细胞色素C释放。1型糖尿病小鼠骨中成骨细胞凋亡增加。一些研究表明IRS1具有抗凋亡能力，IRS1可通过调节Bcl2调控凋亡。本研究组前期试验显示2型糖尿病合并骨质疏松症的发病可能与骨组织IGF1、IRS1、IRS2表达受抑制有关，同时可能与骨组织PI3K、Akt表达降低、NFκB表达升高有关。本研究通过构建pEGFP-N1-IRS1表达载体，转染体外培养的大鼠成骨细胞，同时给予PI3K激酶特异性抑制剂LY294002，观察在有或无LY294002条件下成骨细胞NFκB、BAX表达变化及成骨细胞细胞周期变化，为阐明糖尿病骨病的发生机制提供一条新思路。方法：第一部分：提取Wister大鼠肝脏RNA，逆转录生成cDNA。根据NCBI提供的IRS1基因编码序列，委托DNA合成公司合成带适当酶切位点的引物，以cDNA作为模板合成IRS1，插入pEGFP-N1质粒，获得过表达IRS1的表达载体。体外转染人Hela细胞。第二部分：酶消化联合组织块法体外培养Wister大鼠成骨细胞，倒置显微镜下观察成骨细胞形态，传代至第二代时茜素红染色鉴定成骨细胞。传代至第二代时pEGFP-N1-IRS1表达载体脂质体法LipofectamineTM2000瞬时转染成骨细胞，同时应用PI3K激酶特异性抑制剂LY294002阻断PI3K/Akt通路，免疫荧光和Western blotting法观察成骨细胞NFκB表达变化。第三部分：酶消化联合组织块法体外培养Wister大鼠成骨细胞，传代至第二代时pEGFP-N1-IRS1脂质体法LipofectamineTM2000瞬时转染成骨细胞，同时应用LY294002阻断PI3K/Akt通路，观察成骨细胞IRS1/PI3K/Akt通路及BAX的表达变化。同时检测成骨细胞细胞周期。结果：第一部分：构建质粒经核酸内切酶酶切分析、PCR分析初步判断重组质粒中所插入的片段与预期长度一致。经过测序鉴定，合成的IRS1序列与登录在GenBank上的大鼠IRS1基因序列（GenBank登录号: NM012969.1）高度同源,测序结果发现3个碱基与已发表的IRS1序列不同: NM012969.1的第414、1824、2631位碱基分别是C、C和A，而合成的IRS1片段这3个碱基突变为T、T和G，但合成的IRS1序列翻译的蛋白质和NM012969.1翻译的蛋白质一致。荧光显微镜下IRS1-GFP融合蛋白在Hela细胞成功表达。第二部分：酶消化联合组织块法体外培养Wister大鼠成骨细胞，经HE染色和茜素红染色证明成骨细胞培养成功。荧光显微镜下IRS1-GFP融合蛋白在成骨细胞成功表达；RT-PCR结果表明IRS1表达载体转染组IRS1mRNA表达水平明显增高；Western blotting结果显示IRS1组pAktThr308蛋白水平相对对照组显著增加，LY294002阻断这种作用。免疫荧光和Western Blotting结果均表明IRS1组NFκB p65蛋白水平相对对照组降低，IRS1+LY294002组NFκB p65蛋白表达水平相对IRS1组增加。第三部分：Western Blotting结果表明IRS1组BAX蛋白水平相对对照组显著降低，IRS1+LY294002组BAX蛋白表达水平相对IRS1组增加。细胞周期分析结果表明IRS1组S期增加，促进细胞增殖；IRS1+LY294002组S期降低。结论：1成功构建pEGFP-N1-IRS1表达载体，IRS1-GFP融合蛋白在体外成功表达。2pEGFP-N1-IRS1成功激活成骨细胞PI3K/Akt通路，抑制NFκBp65蛋白表达，PI3K抑制剂LY294002逆转这种作用，推断IRS1通过PI3K/Akt通路抑制NFκB通路。3pEGFP-N1-IRS1诱导的PI3K/Akt通路抑制BAX蛋白表达，PI3K抑制剂LY294002逆转这种作用，推断IRS1通过PI3K/Akt通路抑制BAX表达，促进细胞增殖。