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目的在生物信息学分析人EBI3(Epstein-Barr virus-induced gene 3)蛋白结构基础上,通过质粒构建、GST pulldown、共聚焦免疫荧光和免疫共沉淀等实验技术,研究了人EBI3蛋白及其突变体在哺乳动物细胞中的表达、定位差异及其原因,以及与Sedlin蛋白在体外及哺乳动物细胞内的相互作用,了解氨基酸序列中信号肽的存在对EBI3蛋白细胞定位的影响,探讨EBI3蛋白与Sedlin蛋白发生相互作用的具体结构域位置,以及Asp210定点突变对EBI3蛋白与Sedlin蛋白之间相互作用的影响。方法基于NCBI数据库中人EBI3蛋白的氨基酸序列进行结构域、信号肽的生物学分析。采用PCR的方法,采用含人EBI3全长的cDNA序列的质粒pCDGFP-EBI3为模板,分别扩增野生型人EBI3及其缺失突变体EBI3(1-135)、EBI3(125-230)的序列,酶切凝胶电泳回收目的片段后,插入到酵母表达载体pGADT7、pGBKT7上,构建出人EBI3及其缺失突变体的酵母表达载体质粒;用同种方法构建出真核表达载体质粒pCDNA3.1-EBI3-FLAG、pCDNA3.1-EBI3(1-135)-FLAG、pCDNA3.1-EBI3(125-230)-FLAG以及pCDGFP-EBI3(1-135)、pCDGFP-EBI3(125-230)。用PCR方法,设计含特定位点突变的引物,以pCDNA3.1-EBI3-FLAG为模板,构建将人EBI3的210位天冬氨酸突变为丙氨酸的EBI3 Asp210真核表达质粒pCDNA3-EBI3-D210A-FLAG。分别将下游带FLAG标签的pCDNA3.1-EBI3-FLAG、pCDNA3.1-EBI3(1-135)-FLAG、pCDNA3.1-EBI3(125-230)-FLAG和pCDNA3-EBI3-D210A-FLAG四种质粒单独或与pCDGFP-Sedlin共同瞬时转染入COS7细胞中,用荧光共聚焦显微镜观察EBI3蛋白及其突变体的各自细胞定位,以及与Sedlin蛋白在细胞内的共定位,比较它们表达定位的差异。运用GST-Sedlin融合蛋白及GST Pull-down技术检测EBI3蛋白及其缺失突变体与Sedlin蛋白在体外相互作用的情况。将带有FLAG标签的人EBI3及其突变体的真核表达质粒与pCDGFP-Sedlin共同瞬时转染入HEK 293T细胞,采用免疫共沉实验技术检测在哺乳动物细胞内人EBI3及其突变体蛋白与Sedlin蛋白的相互作用情况。采用内源性免疫共沉淀技术,检测人类胎盘组织中的EBI3与Sedlin蛋白在自然情况下是否有相互作用的情况发生。结果通过NCBI数据库预测出人EBI3的FN3结构域和位置;用SignalP 4.1 Server预测了EBI3蛋白的信号肽、信号肽切割位点;酶切鉴定和测序结果证实质粒均正确构建;Western blotting结果显示带FLAG标签的重组蛋白均能在HEK293T细胞中稳定表达;GST Pull-down实验证明野生型人EBI3蛋白及突变体除了羧基端截短体EBI3(125-230)外,均与Sedlin蛋白存在相互作用。用共聚焦荧光显微镜观察,野生型人EBI3蛋白及其突变体在COS7细胞的细胞质、细胞核与核膜上均有表达,但是表达量有差异,显示EBI3野生型及其缺失突变体在COS7细胞中的定位发生明显变化,而定点突变体pcDNA3.1-EBI3-D210A-FLAG的定位与野生型类似。免疫荧光共定位实验显示EBI3及其突变体与Sedlin均存在不同位置的共定位现象;外源性的免疫共沉淀(co-IP)实验表明野生型人EBI3及其突变体与Sedlin蛋白都存在相互作用;内源性co-IP亦证明了天然存在的EBI3和Sedlin蛋白存在相互作用。结论在COS7细胞中EBI3及其突变体与Sedlin均存在不同位置共定位现象;EBI3 Asp210突变对人EBI3蛋白在细胞内的定位影响甚微;GST Pull-down实验证明野生型人EBI3蛋白及突变体除了羧基端截短体EBI3(125-230)外,均与Sedlin蛋白存在相互作用;外源性免疫共沉淀实验与GST Pull-down实验结果不完全一致提示细胞内蛋白的修饰可能对蛋白质的相互作用产生影响。内源性co-IP实验进一步证实天然存在的EBI3和Sedlin蛋白之间存在相互作用。