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糖皮质激素(glucocorticoid GC)在治疗原发性肾病综合征、支气管哮喘、风湿性疾病、炎症性肠炎、多发性硬化症、淋巴瘤、白血病等疾病时,发挥了很好的作用。但有少数患者对糖皮质激素治疗不敏感,甚至抵抗。造成这种不敏感和抵抗的原因是我们关心的问题。糖皮质激素广泛而复杂的生物学效应是通过糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor GR)介导的,GR存在于胞浆中,结合GC后能形成二聚体,并转移到细胞核中发挥对目标基因的转录调节作用,从而发挥对细胞功能的调节。热休克蛋白90(HSP90)是GC-GR效应全程伴侣蛋白,在GC通过GR介导产生作用的过程中,HSP90起到非常重要的作用(参见图1)。HSP90的质(不同亚型)、量(数量)可能直接影响到GC-GR效应。HSP90是热休克蛋白家族成员之一,占胞浆蛋白的1%～2%。胞浆中HSP90主要有两种亚型,分别是HSP90α(诱导型,小鼠中称为HSP86)和HSP90β(组成型,小鼠中称为HSP84)。HSP90主要以同源双聚体的形式(αα,证据。两亚型的基因组来源、基因序列、mRNA和氨基酸序列都存在很大差别。在诱导方面也存在差别(HSP90α受热诱导而显著升高,HSP90β受丝裂原诱导可显著升高)。提示HSP90亚型在功能上可能存在明显差异。另外,如下的一些现象也引起我们关注:1)HSP90α是诱导性蛋白,当机体受到应激时,HSP90α会很快得到补充和提高;而HSP90β是结构性蛋白,HSP90β(小鼠叫HSP84)的反应和提高则需要一定时间, 6h内存在差异是否说明HSP90α也参与了GC-GR通路;2)HSP90α,HSP90β来自不同的基因,且在HSP90α,HSP90β的c端和铰链区差异较大(是与GR结合和协助GR入核的区域)是否就是这个差异使得只有其中一个亚型在维持GR结构和功能。我们进一步推测:HSP90的质(不同亚型)可能对GC-GR效应有不同贡献。深入研究HSP90亚型对GC-GR通路的作用将有助于阐明HSP90亚型质和量对GC-GR效应的影响,和解决糖皮质激素抵抗问题,也可能为对糖皮质激素治疗不敏感、甚至抵抗的患者带来新的希望。本研究首先构建HSP90α的RNA干扰的真核表达质粒;然后在降低HSP90α的情况下观察GC-GR核转位的变化.最后得到了以下的结果:1.将化学合成的三段寡聚核苷酸与线性化的pSUPER-EGFP载体连接获得了可用于沉默HSP90α基因实验的三个质粒,经酶切鉴定、电泳证明,含作用序列的重组质粒pSuper-HSP90α1, pSuper-HSP90α2,及pSuper-HSP90α3构建是成功的,重组质粒pSuper-HSP90α1, pSuper-HSP90α2测序分析完全正确。实验中先后用不同的脂质体和质粒比例转染HUVEC、HEPG2、HEK 293三种细胞,以绿色荧光蛋白作为评价转染效率的指标,确定HEK-293细胞为靶细胞.在HEK-293中优化转染条件,转染效率可以达到80%左右。2.用半定量PCR的方法,通过与对照质粒转染组和未处理组比较发现: pSuper-HSP90α转染后24小时HEK-293细胞中HSP90αmRNA水平均有下降,pSuper-HSP90α1最明显。3.用western方法,通过与对照转染组和未处理组比较发现:pSuper-HSP90α转染后48小时HEK-293细胞中HSP90α水平明显下降。4.用50 nM GC处理2小时后,细胞核中GR与细胞浆中GR数量的比值增大,表明GR转位到细胞核以发挥调节功能。pSuper-HSP90α转染HEK-293细胞会增强这种GR核浆比值增大的趋势。这种效应都是在质粒转染细胞后48小时观察到的,这提示HSP90α可能直接负调控GR核转位;也可能是HSP90α下降,其他亚型反应性增高间接导致GR核转位增强。