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一、棕色固氮菌突变种DJ35固氮酶钼铁蛋白的纯化、体外重组及结晶研究棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii Lipmann)突变种DJ35的菌体破碎后,所得的未经加热的粗提物经DEAE Cellulose 52柱层析后得到部分纯的钼铁蛋白(△ nifE Avl)和铁蛋白(Av2).部分纯的△nifE Avl再经Sephacryl S-300和Q-Sepharose Fast Flow柱层析进一步纯化,便首次得到SDS凝胶电泳检测为基本纯的△nifE Av1.SDS-PAGE及Western blotting的结果表明,△ nifE Av1具有与野生型棕色固氮菌钼铁蛋白(OP Av1)相同的亚基种类和组成(α2β2).质子还原活性测定表明,在与Av2进行活性互补时△nifE Av1不具有明显的质子还原活性,而与从OP Av1抽提出的FeMoco抽提液保温后便可与Ay2实现活性互补.这表明,△nifE Av1是一种缺失FeMoco的钼铁蛋白.为获得可供X-射线衍射的△nifE Av1的大单晶,对组成蛋白质沉淀剂的各种化合物的种类和浓度、缓冲液的pH值、结晶方法及蛋白样品的批次、浓度等结晶条件进行了大量优化研究.首次获得了△nifE Av1的深棕色短斜四棱柱晶体,并对其蛋白组成进行了鉴定.二、铬铁蛋白中残存的棕色固氮菌细菌铁蛋白的晶体生长及鉴定从无钼、无氨而含铬的固氮培养基中生长的棕色固氮菌突变种UW3中纯化得到了部分纯的CrFe蛋白.在试图培养CrFe蛋白大晶体时发现,棕色晶体和砖红色晶体可同时或单独出现.SDS-和厌氧天然-PAGE皆表明,棕色晶体主要由与Av1类似大小的亚基(~60 kD)组成,而砖红色晶体则主要由~20 kD亚基组成.Western-blotting表明只有~60 kD亚基可与OP Av1的抗体发生反应,而~20 kD亚基则无这种反应.在部分纯的CrFe蛋白中,~20 kD的蛋白含量远低于~60 kD蛋白的含量,表明由这种小亚基组成的蛋白只是CrFe蛋白中的一种污染蛋白.用3,5-二氨基苯甲酸染色的天然电泳表明,形成砖红色和棕色晶体的蛋白是迁移率不同的两种含铁蛋白.质谱分析表明,该晶体蛋白为棕色固氮菌的细菌铁蛋白(AvBF).分辨率为2.34 A的X-射线衍射结果也表明,砖红色晶体属于H3空间群,晶胞参数为a=124.965 A,b=124.965 A和c=287.406 A.首次完成的结构解析也表明,这种砖红色晶体确为24聚体的AvBF.