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本文分为以下几个部分: 第一部分:LID发生、发展与TRH、p-ERK1/2、FosB-ΔFosB等相关信号分子表达变化之间关系的研究 目的:明确LID发生、发展过程中大鼠纹状体全转录本及主要标志信号分子表达水平变化。 方法给予SD大鼠6-OHDA(2μg/μl,4μl)内侧前脑束立体定向注射,复制偏侧急性PD模型,在术后14天通过跨步试验、阿朴吗啡诱导旋转试验检测模型。对于成功PD模型,3天后给予左旋多巴(12mg/kg)和苄丝肼(6mg/kg)治疗,每天规律腹腔注射一次,共21天,复制偏侧LID大鼠模型。隔天一次对大鼠行为学进行AIMs评分;通过免疫组织化学方法检测大鼠黒质多巴胺能神经元毁损情况;通过基因芯片技术检测PD大鼠与LID大鼠纹状体区mRNA全转录水平表达差异;通过qRT-PCR检测纹状体区TRH与FosB转录水平的变化,通过免疫荧光双标法检测TRH与FosB-ΔFosB在纹状体的共表达情况,通过Western blot等技术检测纹状体区TRH、FosB-ΔFosB与p-ERK1/2表达水平。 结果:与PD大鼠相比,LID大鼠毁损侧纹状体区TRH mRNA水平显著升高(P<0.001)。毁损侧纹状体背外侧区TRH与FosB-ΔFosB共表达;在非毁损侧未见二者的表达。TRH mRNA在L-DOPA给药后处于持续高水平表达状态。LID大鼠毁损侧纹状体区TRH、FosB-ΔFosB与p-ERK1/2蛋白水平均高于PD大鼠。 结论:LID的发生与发展伴随大鼠毁损侧纹状体TRH的持续高表达,并且异常表达的TRH可能与LID标志信号分子FosB-ΔFosB相关。 第二部分:TRH对LID发生、发展及对p-ERK1/2等相关信号分子表达影响的研究 目的:观察上调或下调TRH对LID大鼠行为学及纹状体区p-ERK1/2、ΔFosB等相关信号分子表达的影响,明确TRH是否可以直接调控p-ERK1/2的磷酸化水平。 方法:在偏侧LID大鼠模型基础上,每天一次通过颅内置管技术向纹状体背外侧区立体定向注射TRH三肽或TRH类似物Taltirelin,同时30分钟后给予腹腔注射左旋多巴和苄丝肼,持续1周。包装慢病毒LV-TRH-shRNA-GFP,感染PC12细胞,筛选可以有效干扰TRH mRNA的序列。将TRH有效干扰序列包装成腺相关病毒AAV-TRH-shRNA-GFP,并立体定向注射至纹状体背外侧区,4周后开始给予每天一次腹腔注射左旋多巴和苄丝肼,持续1周,每天进行AIMs评分,第7天处死大鼠并检测纹状体区TRH、p-ERK1/2、FosB-ΔFosB的表达水平。培养PC12细胞,分别用溶剂(Vehicle)、MEK抑制剂(U0126)、TRH受体TRH-R1抗体(Anti-TR1)孵育细胞,2小时后分别给予细胞TRH三肽、TRH类似物Taltirelin干预,通过Western Blot技术检测p-ERK1/2的磷酸化水平在不同处理条件下的差异。结果TRH三肽、TRH类似物Taltirelin均可以显著加重异动症,增加p-ERK1/2、Δ 结果:FosB的表达;AAV-TRH-shRNA下调TRH表达可以显著减轻异动症,减少p-ERK1/2、ΔFosB的表达。TRH三肽、TRH类似物Taltirelin可以明显增加p-ERK1/2的磷酸化水平,并且这种升高效应可以被MEK抑制剂U0126及TRH-R1抗体所抑制。 结论:TRH通过正向调控ERK1/2磷酸化与ΔFosB的表达而参与LID的发生与发展。 第三部分:p-ERK1/2对FosB-ΔFosB与FosB-ΔFosB对TRH表达调控的研究 目的:观察MEK抑制剂U0126对LID大鼠行为学以及FosB-ΔFosB、TRH等信号分子的调控。通过过表达FosB基因,明确FosB-ΔFosB对TRH的调控。 方法:在偏侧PD大鼠模型基础上,给予每天一次腹腔注射左旋多巴和苄丝肼,持续21天。隔天一次进行AIMs评分。自左旋多巴给药第10天起,每天提前30分钟通过留置导管向纹状体立体定向注射MEK抑制剂U0126,第21天处死大鼠,通过qRT-PCR技术检测TRH mRNA、FosB mRNA表达水平,通过Western Blot技术检测p-ERK1/2、ΔFosB等信号分子的表达。包装过表达FosB基因慢病毒LV-FosB-GFP,感染PC12细胞,通过qRT-PCR技术检测TRH mRNA表达水平。 结果:MEK抑制剂U0126可以显著降低AIM行为学评分,减轻异动症,减少FosB-ΔFosB、TRH的表达。过表达FosB可以显著增加TRH的表达。 结论:p-ERK1/2可以正向调控FosB-ΔFosB与TRH。FosB-ΔFosB可以正向调控TRH。