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根据GenBank上发表的金黄色葡萄球菌RF122β-溶血素(hlb)基因序列,用OLIGO6.0设计一对PCR引物,对金黄色葡萄球菌山东分离株zfb的hlb基因进行PCR扩增、序列测定及生物信息学分析。测序结果表明,扩增片断含有993 bp的ORF,可编码含330个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的金黄色葡萄球菌RF122β-溶血素蛋白的氨基酸组成同源性为99.4%。软件分析显示我们克隆的金黄色葡萄球菌山东分离株zfb的β-溶血素氨基酸序列中含有核酸内切酶/核酸外切酶/磷酸酶(Endonuclease/Exonuclease/phosphatase family)和金属依赖性水解酶ELSH(Metal-dependent hydrolase)两个保守结构域,说明我们克隆的金黄色葡萄球菌β-溶血素是一种依赖于金属离子的磷脂酶;进化树分析可见牛源金黄色葡萄球菌山东分离株zfb的β-溶血素与其它β-溶血素/磷脂酶既有高度的同源性,又存在一定的差异。通过对pMD18-T/hlb及pET32a+进行BamHⅠ、HindⅢ双酶切、连接,将hlb基因定向插入pET32a+,经BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定表明,成功构建重组表达质粒pET32a+/hlb,并转化入表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,表达产物以融合表达的包涵体形式存在,SDS-PAGE分析重组蛋白表达水平,IPTG诱导后表达的融合蛋白分子量为57KD,表达量占菌体总蛋白的23.9%。表达产物利用重组表达蛋白所带的6×His标签用镍柱亲和层析方法对其进行纯化,并用96孔血凝板测定重组蛋白的溶血效价,结果显示金葡菌β-溶血素对绵羊红细胞的溶血效价为278 HU/mg,对奶牛红细胞的溶血效价为9×10~3HU/mg;以血琼脂平板法检测重组蛋白与无乳链球菌的CAMP反应,结果显示重组蛋白在血琼脂平板上和无乳链球菌能发生明显的CAMP反应。上述结果表明,我们成功克隆并表达了牛乳中金黄色葡萄球菌β-溶血素,纯化后的重组蛋白保存了很好的溶血活性,而且该毒素对奶牛红细胞的溶血活性明显大于绵羊红细胞,显示出牛源金黄色葡萄球菌β-溶血素具有明显不同于人源金黄色葡萄球菌β-溶血素的特性,为进一步研究金黄色葡萄球菌β-溶血素的致病与免疫机理、疫苗设计提供条件。此外,重组蛋白具有和无乳链球菌发生CAMP反应的性质,可用来特异性诊断、鉴别无乳链球菌,为兽医临床诊断提供新的方法。