背景:前列腺癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一,是美囯和欧洲癌症相关死亡的重要原因,近年来其在我国的发病率亦呈逐年快速上升趋势。在引入前列腺特异性抗原(PSA)筛查后,前列腺癌的检出率在20世纪90年代早期达到峰值。现在,大约85%的新诊断患有前列腺癌的男性局限在早期肿瘤。尽管常规PSA筛查的普及提高了前列腺癌的早期检测率,但对于它带来的益处仍然存在争议,主要原因在于目前尚未对PSA是否能够有效降低前列腺癌的死亡率上达成共识。PSA是前列腺但不是前列腺癌特异性的检测指标,并且可能由于诸如感染,炎症或良性前列腺增生(BPH)等原因而发生波动。PSA水平和前列腺癌之间的差异性导致潜在的过度诊断和过度治疗。由于前列腺癌具有肿瘤异质性的特点,探索新型分子标记物用于前列腺癌的诊断及预后分层,以及新的分子治疗靶点,将成为研究者的主要任务,而这对加速前列腺癌的诊断,预后和治疗效果,对开辟精准医疗一个崭新的方向具有重要的临床意义。除了已经在各种临床情况中显示临床效用的蛋白质和信使RNA(mRNA)之外,研究者们对微小RNA(miRNA)作为前列腺癌的生物标志物和靶向治疗的潜在效应的兴趣日益增长。miRNA是在进化上保守的长度约为18-22个核苷酸的非编码单链RNA分子,其主要作为转录后基因调节剂。最初通过RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ作为长初级转录物(pri-miRNA)在核中转录,随后通过由RNA酶Ⅲ酶Drosha及DGCR8相互结合组成的微处理器复合物将miRNA加工成70至100nt前体RNA(pre-miRNA)。之后Exportin-5/RanGTP介导pre-miRNA转位到细胞质,·经过RNA酶Ⅲ核酸内切酶Dicer和TRBP进一步加工成19至25-nt双链体。Dicer的最终加工可能最终导致两条链装配成RNA诱导的沉默复合物(RISC),RISC复合物的关键组成部分是Argonaute蛋白。在RISC内,miRNA通过结合靶mRNA的3’非翻译区(UTR),或者与5’UTR或编码序列的不完全结合,改变它们的稳定性来调节靶mRNA的翻译。因此,miRNA可以以完全互补结合的方式直接靶向mRNA降解,或通过不完全结合等方式诱导翻译抑制。与此同时,很多研究已经证明miRNA不仅抑制靶mRNA的表达,而且在一些情况下也可能能够通过与微核糖核蛋白例如Ago2和FXR1的相互作用直接或间接激活靶基因表达。由于这些调节机制的复杂性,以及每个miRNA可以调节多个mRNA的表达,而且,每个mRNA可以被几种不同的miRNA靶向,所以可以想象出它作用的广泛性,miRNA已经显示涉及几乎所有的关键细胞过程,如增殖,分化,迁移,凋亡和干细胞维持。而癌症相关miRNA表达的改变可能受染色体重排,启动子甲基化或转录失调等影响。事实上,20-40%的miRNA位于CpG岛附近,证实了它们潜在的表观遗传沉默,特别在泌尿系统疾病中已有研究表明这种现象存在。miRNA通常位于脆弱的染色体位点内,在肿瘤进展过程中表现出DNA扩增,缺失或易位。一些单个miRNA已被证明为肿瘤抑制基因或癌基因,这取决于其调控的下游靶标,这些特征使得它们更具有潜在的应用价值,且有大量相关文章发表并引起同行热议。越来越多的文献特别研究了 miRNA作为癌症诊断,预后和治疗中的生物标志物价值,并将其水平与临床病理参数联系进行分析。在临床前列腺组织样品中特异性miRNA的表达水平的评估可用于检测癌症,预测癌症预后并监测其进展,以及作为治疗选择和应答的标志物。目的:首先,在收集的前列腺癌血清标本以及前列腺癌细胞株中利用荧光定量PCR法检测miR-493-5p的表达情况。其次,观察miR-493-5p对前列腺癌细胞系PC-3和DU-145的生物学功能的影响。最后,我们综合生物信息学预测和构建荧光素酶双报告系统探索miR-493-5p的直接作用靶点,同时通过分析靶基因的生物学功能,证实miR-493-5p对于靶点的调控价值,并探索其下游介导的分子信号通路。方法:1)在59例前列腺癌症穿刺阳性患者血清标本和69例前列腺增生切除术后病理良性的患者血清标本中检测miR-493-5p的相对表达量,随后统计分析miR-493-5p在前列腺癌组和增生组血清标本中的差异性表达,同时分析不同病理级别与临床分期的前列腺癌中miR-493-5p表达差异;2)通过在前列腺癌细胞株PC-3和DU-145中转染miR-493-5p模拟体(mimic)来上调miR-493-5p表达量,从而进一步探索其表达量对癌细胞一系列功能的影响。主要通过平板克隆形成、CCK-8和Transwell实验等方法来探索上调miR-493-5p的表达对于细胞增殖和迁移侵袭能力的影响;3)综合利用在线生物信息学预测网站对miR-493-5p的直接靶向基因进行初步预测及筛选,然后利用荧光定量PCR和Western Blot等证实靶基因mRNA和蛋白水平表达的变化,并利用荧光素酶双报告实验对miR-493-5p的靶向序列进行鉴定,并进一步使用RNA干扰等实验来明确靶向调控关系和下游机制。结果:1)miR-493-5p在前列腺癌中表达下调。我们使用荧光定量PCR在59例前列腺癌患者及69例前列腺增生患者的血清标本,以及前列腺癌细胞系PC-3,LNCaP和DU-145中检测了 miR-493-5p的相对表达水平。结果发现miR-493-5p在肿瘤组中的表达量相比非肿瘤组显著降低。而且miR-493-5p在去势抵抗的PC-3和DU-145细胞株中的表达量要明显低于激素依赖的LNCaP细胞株。2)随后我们进行的一系列的如CCK-8、平板克隆形成和Transwell实验等获得性功能实验结果提示过表达miR-493-5p可以抑制前列腺癌细胞的增殖和侵袭迁移能力。此外,上调miR-493-5p的表达还能抑制前列腺癌细胞的上皮间质转化过程(EMT),后者主要是通过调节AKT/GSK-3β/Snail信号来介导。3)成功构建裸鼠的皮下前列腺PC-3肿瘤模型。瘤内给予脂质体包裹的miR-493-5p,观察到移植瘤的生长受到明显抑制。4)通过在线软件的分析,将序列比对程序分析结果与细胞表型变化相结合,预测EGFR、CREB1和c-MET可能是miR-493-5p的主要靶基因,同时通过定量RT-PCR 和 Western Blot 技术检测到 EGFR、CREB1 和 c-MET 在过表达 miR-493-5p后mRNA水平或蛋白水平都有下调。而进一步荧光素酶报告系统分析亦证实EGFR、CREB1和c-MET是miR-493-5p的直接作用靶点,其3’-UTR中存在miR-493-5p调控的作用序列。5)我们使用RNA干扰技术下调CREB1、EGFR和c-Met的表达量,结果发现细胞的迁移侵袭能力和EMT进程受到抑制,其主要也是通过调节AKT/GSK-3β/Snail通路所介导的,这和miR-493-5p在前列腺癌中的功能相一致。6)最后综合我们的研究结果与前人已发表的研究构建出了 miR-493-5p对靶基因c-Met、EGFR和CREB1的调控网络,同时发现CREB1亦可以间接调控c-Met的表达。结论:1)miR-493-5p在前列腺癌组标本的表达量与前列腺增生组标本相比显著下调,而且在去势抵抗的PC-3和DU-145细胞株中的表达量要明显低于激素依赖的LNCaP细胞株。2)过表达miR-493-5p可以抑制前列腺癌细胞的增殖、平板克隆形成、上皮间充质转化过程(EMT)和迁移侵袭。而EMT过程是miR-493-5p调控AKT/GSK-3β/Snail信号通路来介导的。3)CREB1、EGFR和c-Met是miR-493-5p的直接作用靶点,这些基因也可以通过调节AKT/GSK-3β/Snail信号通路来抑制肿瘤侵袭和迁移。4)由于miR-493-5p和三个靶基因之间存在调控网络,其中CREB1亦可以间接调控c-Met的表达。