本文采用遗传灭活的长牡蛎(Crassostrea gigas)精子诱导栉孔扇贝(Chlamys farreri)异精雌核发育四倍体;采用种间杂交方法诱导栉孔扇贝(C.farreri♀)×虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis♂)异源四倍体。采用染色体制片技术、早期胚胎压片技术、组织切片技术、荧光(免疫荧光)显微观察、基因组荧光原位杂交技术(GISH)等细胞遗传学手段对以上两种技术诱导扇贝的四倍体及其细胞遗传学进行了研究,为贝类四倍体的诱导提出了新的研究思路。研究内容及结果如下:第一部分:采用遗传失活的长牡蛎精子诱导栉孔扇贝异精雌核发育四倍体1.1长牡蛎精子的遗传灭活:采用强度为1500uw/cm2的紫外线照射长牡蛎精子,使其失去遗传活性,然后与栉孔扇贝卵子授精,诱导栉孔扇贝异精雌核发育单倍体。受精率、早期胚胎成活率和单倍体率结果表明,1500uw/cm2的紫外线照射长牡蛎精子60s是获得栉孔扇贝异精雌核发育单倍体的适宜条件。随着照射时间的延长,受精率明显下降,早期胚胎成活率呈现“Hertwig”效应。1.2栉孔扇贝异精雌核发育四倍体的诱导:遗传失活的长牡蛎精子与栉孔扇贝卵子授精,50mg/L 6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)抑制受精卵第一极体和第二极体的排出,持续处理35min。采用滴片法对诱导后代担轮幼虫进行倍性分析,结果表明:诱导后代幼虫的倍性复杂,包括四倍体(6.25%)、单倍体(8.33%)、二倍体(13.54%)、三倍体(5.21%)和大量的非整倍体(66.67%)。说明采用本方法能够诱导出一定比例的雌核发育四倍体。1.3细胞学观察:分别采用二脒基苯基吲哚(DAPI)荧光染色和石蜡切片法在显微镜下观察栉孔扇贝异精雌核发育四倍体在受精和早期胚胎发育过程中的核行为变化。结果表明:被遗传灭活的长牡蛎精子能够与栉孔扇贝卵子正常受精,但发育速度较对照组缓慢。遗传灭活的长牡蛎精核进入栉孔扇贝卵子后发生轻微膨胀,至原核形成期,四倍性雌核发生融合。在此过程中,精核一直处于凝缩状态,不解凝,不形成雄性原核。在第一次卵裂中期,精核形成一致密的染色质小体(DCB),位于两组分开的母本染色体之间,不参与核分裂;第一次卵裂结束时DCB滞留于两卵裂球的分裂沟上或进入其中一分裂球中;第二次卵裂过程中,DCB的去向与第一次卵裂时基本一致。同时观察到多种倍性的胚胎、核物质分离紊乱、染色体呈现多极分离现象,并对这些现象进行了分析。第二部分:栉孔扇贝(♀)与虾夷扇贝(♂)杂交诱导扇贝异源四倍体2.1扇贝异源四倍体的诱导及条件优化:采用压片、滴片、流式细胞术对扇贝异源四倍体诱导后代的倍性构成进行分析。综合受精率、D形幼虫率、幼虫的发育状况及倍体比率等参数,本实验得出50mg/L 6-DMAP持续处理异源受精卵15min抑制第一极体的释放为适宜诱导组合。流式细胞仪检测结果表明处理15min诱导组获得17.30%的四倍体,染色体滴片结果表明处理15min诱导组获得6.84%的四倍体,两种技术获得结果差异较大,对其原因进行了分析。2.2染色体分离行为的细胞学观察:结果发现,6-DMAP抑制异源受精卵第一极体的释放改变了正常的染色体分离行为。在第二次减数分裂过程中出现了多种分离方式,其中“联合二极分离”所占比例最多,为75.50 %;“三极分离”占7.39%;“独立二极分离”占6.20%;其它为“紊乱分离”,占10.91%。染色体分离方式结合倍性结果综合分析表明:“独立二极分离”是形成四倍体的主要机制;而“联合二极分离”、“三极分离”与“紊乱分离”将主要形成非整倍体。另外,对各种分离模式形成的机制进行了探讨。2.3早期胚胎核行为观察:DAPI染色荧光显微观察结果发现排放1个极体、排放2个极体和不排放极体三种类型的受精卵,所占比例依次为54.35%、30.9%和14.75%。依据极体的排放情况将分别导致产生二倍体、三倍体、四倍体、五倍体和非整倍体。观察中还发现核物质分离紊乱及雌核发育等现象。2.4早期胚胎纺锤体和染色体分离行为:对免疫荧光固定液及其缓冲液体系进行筛选,结果表明0.2M PBS(pH7.4)配制的4%多聚甲醛固定液为适宜的固定液体系。采用异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的抗α管蛋白(anti-α-tubulin)特异性地标记纺锤体,同时采用碘化丙锭PI(Propidiumiodide)标记染色体,显微观察表明:在成熟受精卵开始受精到第二次卵裂过程中,整个细胞的微管骨架发生了剧烈变化。同时发现染色体多极分离现象,与压片法观察结果相一致,主要为“三极分离”和“独立二极分离”。染色体核行为变化同DAPI荧光染色观察结果相似,同时也在早期胚胎中发现个别雌核发育胚胎。2.5诱导后代的细胞遗传学分析:采用GISH技术结合染色体滴片技术对扇贝异源四倍体诱导后代的染色体遗传构成进行研究,对授精后17h～66h内6个时间段各300多个分裂相进行统计分析。结果表明,诱导异源四倍体过程中产生了多种倍性的幼虫,包括5.192%的四倍体、16.577%的三倍体以及单倍体、二倍体、五倍体和大量的非整倍体。在17h～66h内同一组染色体数所占比率并未出现随着取样时间的变化而出现明显上升或下降的趋势。在染色体构成上,诱导后代分别继承了双亲的染色体,除异源二倍体外均为非对称性继承,且继承方式上属偏母本继承。GISH鉴定结果表明本实验所获得的四倍体为真正的异源四倍体,同时也说明两套异源染色体具有较强的亲和性。在诱导后代中出现较小比例的染色体不完全继承个体。本文就产生这些现象的可能原因进行了探讨。