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在食品加工过程中,以荞麦尤其是苦荞麦为原料制备的食品存在一定的苦涩味,严重影响口感,降低了荞麦的利用价值。芦丁水解酶(rutin-hydrolyzing enzyme,RHE)通过水解芦丁生成的槲皮素是其苦涩味产生的主要原因。因此,若将苦荞芦丁水解酶基因(Fagopyrum tartaricum rutin-hydrolyzing enzyme,FtRHE)敲除,则有可能获得无苦涩味的荞麦,更加有利于荞麦的利用及推广。尽管国内外在芦丁水解酶的性质、底物特异性等方面已经做了一些的研究,但是迄今为止还未见RHE的DNA序列的相关报道。本课题组从苦荞转录组中克隆得到芦丁水解酶基因FtRHE并在昆虫杆状病毒系统中进行表达研究。主要完成以下研究内容:1.FtRHE基因的序列鉴定。为获得苦荞麦中FtRHE基因,以云荞1号苦荞种子为材料,制备获得天然RHE,通过MALDI-TOF/TOF-MS鉴定天然RHE序列信息,结合转录组数据,筛选FtRHE。结果显示,纯化的天然RHE分子量约为62 kD,肽质量指纹图谱证明其为一种β-葡萄糖苷酶,质荷比为914.4286的肽段FSISWSR为其特征肽段。在苦荞种子转录组数据中筛选获得FtRHE基因序列基础上,通过反转录PCR获得了苦荞芦丁水解酶基因FtRHE。FtRHE开放阅读框由1539个碱基组成,编码512个氨基酸,1-29位氨基酸为其信号肽。多重序列比对表明RHE与有物种差别的β-葡萄糖苷酶氨基酸保守性不是特别高,同源性普遍集中在54%—62%之间。由生物化学,分子生物学方法结合软件分析发现,RHE分子中有4个疏水区;它的二级结构由48.44%无规则卷曲、37.30%α-螺旋和14.26%β-折叠组成;其结构域含有与糖苷水解酶家族1相同的(β/α)8TIM桶状结构域。进一步根据芦丁水解酶相关结构预测,发现其活性位点可能是第200位的谷氨酸和第412位的谷氨酸。2.FtRHE基因表达系统的构建及表达。为了获得与天然RHE相同生物学活性的重组型RHE,为后续功能研究奠定基础,我们首先构建了FtRHE的原核表达载体,其中包括PRSETC、pGEX-4T-1、pET-32a这些在大肠杆菌中表达的载体,并通过测序鉴定正确再进行诱导表达,结果未发现特异条带。我们尝试基于大肠杆菌的密码子偏好优化序列,去掉信号肽区域表达仍未成功。因此,改用昆虫杆状病毒表达系统,首先构建真核表达载体,通过转化DH10Bac感受态细胞构建Bacmid-FtRHE重组杆粒,转染昆虫细胞Sf9后,成功表达了具有较高芦丁水解酶活性的重组FtRHE。酶活测定实验结果表明,我们表达的FtRHE与苦荞中天然提取的RHE活性类似。该研究为高含量芦丁及无苦涩味荞麦育种以及由芦丁生物转化生产槲皮素等的应用奠定了良好的基础。