第一部胰岛素对雌激素受体α甲基化调控在血管平滑肌细胞增殖中的作用研究研究背景冠状动脉粥样硬化性心脏病和2型糖尿病目前是世界上高发的两大疾病,也是人类两大致死病因,分别位于死因排名的第一位和第八位。2型糖尿病常伴随着胰岛素抵抗,即胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率降低,继发内源性胰岛素代偿性分泌增多,导致产生高胰岛素血症。大量研究发现胰岛素抵抗及相继出现的高胰岛素血症是动脉粥样硬化形成和发展的独立危险因素,同时促进了血管损伤后再狭窄的发生。英国大样本糖尿病临床研究(ACCORD)表明,有效控制血糖、血压可以减少微血管病变的发生率,但并不减少冠心病等大血管病变的发生率,这种现象与糖尿病患者伴有胰岛素抵抗相关。DCCT/EDIC研究小组发现:糖尿病患者对胰岛素敏感性降低导致胰岛素抵抗,其血浆胰岛素水平显著增高,动脉粥样硬化的发生率也显著高于对胰岛素敏感的患者。血管平滑肌细胞位于动脉血管壁的中层,调节动脉血管的收缩和舒张,同时具有一定的分泌功能。在致病因素的作用下其收缩性降低,分泌功能得到增强,可分泌、释放一些炎性因子,即发生了细胞表型的转化,由收缩表型转化为分泌表型,并增加了血管平滑肌细胞的增殖和迁移功能,从而促进动脉粥样硬化的形成和发展。有大量的研究已经证实高胰岛素血症能够促进血管平滑肌细胞的增殖、迁移及表型转化。随着表观遗传学的发展,有研究发现在动脉粥样硬化过程中伴有DNA高甲基化现象。表观遗传学改变调控基因表达的机制是,在不改变DNA序列的情况下,改变基因的表达方式,而且这种基因表达方式的改变能够通过细胞分裂传递到子代细胞甚至机体的下一代,主要包括DNA甲基化、组蛋白乙酰化和mi RNA。而表观遗传学改变又是可逆的,这已经被一些酶的抵消作用所证实,因而使得表观遗传性疾病具有治愈的可能。关于动脉粥样硬化与DNA甲基化关系的最早的一项研究发现,在兔动脉粥样硬化斑块中细胞外过氧化物歧化酶基因甲基化程度显著降低。而另外一项研究通过比较外周血白细胞DNA的甲基化敏感性限制发现了DNA高甲基化与动脉粥样硬化易感性和自然病程的呈正相关,这一研究进一步强调了DNA甲基化在动脉粥样硬化发病机制中的重要促进作用。血管平滑肌细胞表型转化在动脉粥样硬化的发生、发展中发挥了重要的作用,由正常的收缩表型转化为分泌表型,促进平滑肌细胞的增殖、迁移。Seppo等学者发现在此过程中伴有基因低甲基化现象,但甲基转移酶的表达反而增强。因而推测在动脉粥样硬化血管平滑肌细胞表型转化过程中可能同时存在基因高甲基化及低甲基化。既往的研究已证实,胰岛素抵抗能够诱导血管平滑肌细胞的表型转化,同时也有研究发现胰岛素抵抗能够诱导基因的异常甲基化,如Kim等学者研究发现,胰岛素抵抗可诱导阴茎海绵体平滑肌细胞中的雄激素受体启动子发生甲基化,从而抑制雄激素受体的表达。由此我们提出假设,基因的异常DNA甲基化可能参与了胰岛素抵抗诱导血管平滑肌细表型转化的作用机制。雌激素是人体一个重要激素,它除了对生殖系统的作用以外,对心血管系统也具有十分重要的保护作用。雌激素是通过与雌激素受体结合来发挥其生理作用的,更有研究发现雌激素主要通过ER-α发挥抗动脉粥样硬化的作用。正常ER-α具有抑制生长的作用,可减少ROS的形成和ERK的磷酸化,而这是高血糖诱导血管平滑肌细胞增殖的重要机制之一。有研究在动脉粥样硬化斑块中发现ER-α基因甲基化程度增加,致使其抑制生长的作用受到抑制,从而促进血管平滑肌细胞的增殖。由此我们提出假设:胰岛素是否可通过影响ER-α的甲基化促进血管平滑肌细胞的增殖及动脉粥样硬化的形成和发展。我们采用ApoE/Lepr双基因敲除小鼠和大鼠VSMCs进行实验研究,从动物和细胞两个层面观察胰岛素对ER-α的表达及甲基化的作用。上述问题的解决有助于阐明胰岛素促进VSMCs增殖和动脉粥样硬化的新机制,为动脉粥样硬化的治疗提供新的靶点。研究目的研究ER-α甲基化在胰岛素促进血管平滑肌细胞的增殖及动脉粥样硬化中的作用。研究内容和方法1.观察胰岛素对ApoE/Lepr双基因敲除小鼠主动脉动脉粥样硬化斑块形成的影响及对主动脉VSMCs细胞核ER-α表达的作用。对8周龄的ApoE/Lepr双基因敲除小鼠分别腹腔内注射胰岛素或生理盐水,每周检测小鼠的体重和空腹血糖,连续12周后对小鼠主动脉石蜡切片进行HE染色和ER-α免疫组化实验。2.观察胰岛素对大鼠血管平滑肌细胞ER-α、DNMT1、DNMT3a表达的作用。胰岛素干预大鼠血管平滑肌细胞后,分别用Western blot和q PCR方法检测大鼠VSMCs ER-α、DNMT1、DNMT3a蛋白及m RNA的表达。3.观察甲基转移酶抑制剂5-Aza对胰岛素抑制大鼠血管平滑肌细胞ER-α表达的作用。分别用5-Aza或5-Aza与胰岛素共同干预大鼠VSMCs,用Western blot和q PCR方法检测大鼠VSMCs ER-α蛋白及m RNA的表达。4.观察胰岛素对大鼠VSMCs ER-α甲基化的作用。分别用胰岛素或5-Aza与胰岛素共同干预大鼠VSMCs,用BSP方法检测VSMCs ER-α甲基化水平。5.观察上调大鼠VSMCs ER-α的表达对VSMCs增殖和迁移能力的影响。构建ER-α高表达慢病毒载体,并感染大鼠VSMCs,用流式细胞术检测ER-α高表达VSMCs的细胞周期,用CCK-8和Ed U检测细胞的增殖情况,划痕实验检测细胞的迁移情况。6.观察大鼠VSMCs ER-α第二外显子调控序列甲基化水平对基因转录活性的影响。首先,构建ER-α第二外显子调控序列p GL3-promoter荧光素报告载体;其次,大鼠ER-α第二外显子调控序列进行体外人工甲基化,并用甲基化敏感性限制性内切酶(Aci I)酶切鉴定;最后,甲基化和模拟甲基化ER-α第二外显子调控序列p GL3-promoter荧光素报告载体分别转染293FT细胞,并用双荧光素酶报告基因检测基因转录活性。研究结果1.ApoE/Lepr双基因敲除小鼠腹腔内注射胰岛素或生理盐水12周后,两组小鼠的体重、血糖无明显差异,胰岛素组小鼠的胰岛素水平及HOMA-IR显著高于对照组。2.ApoE/Lepr双基因敲除小鼠主动脉石蜡切片HE染色结果显示,胰岛素组小鼠的主动脉壁显著增厚,并出现显著的动脉粥样硬化斑块,血管腔变窄,中层平滑肌细胞增多,细胞核排列紊乱。而对照组小鼠主动脉内膜光滑,管腔无狭窄,血管壁无增厚,中层平滑肌细胞核排列整齐。ER-α免疫组化结果显示,胰岛素组小鼠主动脉平滑肌细胞核上的ER-α表达显著低于对照组小鼠。3.胰岛素干预大鼠VSMCs后ER-α蛋白和m RNA的表达均显著降低,并随干预时间的延长而进一步降低;而DNMT1、DNMT3a蛋白及m RNA的表达则显著增加,并且随干预时间的延长而增加。4.5-Aza与胰岛素共同干预大鼠VSMCs后ER-α蛋白的表达较对照组显著增加,m RNA的表达与对照组无明显差异。5.胰岛素干预大鼠VSMCs后ER-α第二外显子甲基化水平增加,而5-Aza与胰岛素共同干预后ER-α第二外显子甲基化水平较对照组和胰岛素组均显著降低。6.用ER-α高表达慢病毒感染大鼠VSMCs,上调ER-α的表达后,流式细胞术及CCK-8、Ed U结果均显示VSMCs的增殖受到抑制,划痕实验结果显示VSMCs的迁移能力同样也受到抑制。7.大鼠VSMCs ER-α第二外显子调控序列能够增强基因转录活性,而在大鼠VSMCs ER-α第二外显子调控序列甲基化后基因转录活性受到抑制。研究结论胰岛素能够促进ApoE/Lepr双基因敲除小鼠动脉粥样硬化的发生、发展,并降低主动脉平滑肌细胞ER-α的表达。其机制是胰岛素是通过诱导VSMCs ER-α第二外显子甲基化降低ER-α的表达,从而促进VSMCs的增殖和迁移及动脉粥样硬化的形成。本研究阐明了胰岛素促进VSMCs增殖和致动脉粥样硬化的新机制,为动脉粥样硬化性疾病的治疗提供了新的治疗靶点,也为是否采用胰岛素治疗提供新的理论依据。第二部胰岛素抵抗与雌激素受体α甲基化在冠心病患者中的相关性研究研究背景冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease,CAD)和糖尿病是世界两大常见病、多发病,我国的患病率随着人民生活水平的提高、人口老龄化及生活方式西方化的改变而迅速增加。糖尿病与冠心病关系密切,冠心病是糖尿病的一个最主要的并发症及致死因素,糖尿病人群中冠心病的患病率高达非糖尿病人群的2-4倍,发病年龄更年轻,病情进展更快,约65%的糖尿病患者死于冠心病。其中高血糖、胰岛素水平升高、血管内皮功能紊乱、血管平滑肌细胞功能异常等直接或间接促进了冠心病的发生、发展。芬兰和加拿大魁北克地区的临床研究发现,伴有高胰岛素血症的糖尿病患者其冠心病的发病率更高、并且更严重。胰岛素是一个调控血糖平衡的激素,大量的证据证明胰岛素作为一个血管扩张激素能够维持血管内平衡,胰岛素抵抗往往伴随着血管疾病的发生。血管平滑肌细胞在动脉粥样硬化的形成和发展中发挥有重要的作用,平滑肌细胞的增殖、迁移、产生的细胞外基质参与了动脉粥样硬化斑块的早期形成,并有助于维持斑块的稳定性。而胰岛素能促进血管平滑肌细胞的增殖、迁移和对葡萄糖的摄取,从而加重动脉粥样硬化。然而,胰岛素是如何调控血管平滑肌细胞的功能的,目前尚不完全清楚。随着表观遗传学的发展,DNA甲基化为胰岛素促血管平滑肌细胞增殖作用机制的研究指出新的方向。表观遗传学指的是在DNA序列不发生变化的基础上,基因表达发生可遗传的功能改变,包括DNA甲基化、组蛋白乙酰化及mi RNA。其中,在人类基因组中DNA甲基化是研究最为广泛的。DNA甲基化是在DNA甲基转移酶的作用下,在基因组Cp G岛胞嘧啶环上第5位碳原子上的甲基化。这种改变是可逆的,也是可以遗传到子代的。已经有一些研究发现了一些特定的平滑肌细胞基因受到DNA甲基化调控。这些平滑肌细胞中的基因与平滑肌细胞的分化、迁移、表型转化密切相关,包括那些编码血小板趋化因子(PDGF)、血清效应因子(SRF)和SMC特异的SM-α、ER-α和ER-β的基因。在动脉粥样硬化的发生、发展中,血管平滑肌细胞的DNA甲基化发挥了十分重要的作用。雌激素又称女性激素,它能促进女性性器官的成熟及第二性征的出现,男性体内同样含有雌激素,雌激素对人类的心血管系统具有重要的保护作用。多项研究证实给女性或男性患者补充雌激素能够促进血管的舒张及改善心肌供血。雌激素能够增加血管舒张物质的释放,并降低血管收缩物质的产生及其作用。雌激素在与雌激素受体结合后方能发挥各种生理作用,雌激素受体中ER-α是一个潜在的生长抑制基因,发挥了重要的抗动脉粥样硬化作用,Jana Ortmann等研究发现ER-α能够抑制高血糖诱导的人血管平滑肌细胞的增殖,而ER-β及GPER则无此作用。ER-α能够提高心肌的葡萄糖利用,促进缺血再灌注后心功能的恢复并减少梗死。ER-α基因甲基化是导致ER-α表达降低的重要机制之一,有学者发现动脉粥样硬化患者基因组ER-α甲基化水平显著增加的现象。我们前期的研究发现胰岛素能够诱导大鼠血管平滑肌细胞ER-α的甲基化,降低ER-α的表达,从而促进血管平滑肌细胞的增殖、迁移和表型转化。为进一步明确胰岛素抵抗与ER-α基因甲基化在冠状动脉粥样硬化性心脏病中的相关性,我们分析比较伴有或不伴胰岛素抵抗的冠心病患者,其外周血基因组DNA ER-α甲基化水平的差异。研究目的明确胰岛素抵抗与ER-α基因甲基化在冠状动脉粥样硬化性心脏病中的相关性。研究内容和方法1.选取解放军第三军医大学第三附属医院2014年12月-2016年6月期间经冠脉造影术确诊为冠状动脉粥样硬化性心脏病,伴有或不伴胰岛素抵抗的患者共96人,排除伴有脑、肝、肾等重要器官严重病变的患者。采集年龄、性别、长期吸烟史、主要合并症等一般临床资料,并检测血糖、血脂、肝肾功、胰岛素水平等生化指标,根据HOMA-IR分为胰岛素抵抗组及非胰岛素抵抗组。2.入选患者采集肘静脉血,提取全血基因组DNA,采用甲基化质谱检测技术检测基因组ER-α甲基化水平。3.统计分析伴有胰岛素抵抗和不伴胰岛素抵抗的冠心病患者基因组ER-α甲基化水平,并分析HOMA-IR、年龄及性别对ER-α甲基化水平的影响。研究结果1.入选的两组患者在年龄、性别比、吸烟史、空腹血糖、血脂、肝肾功及主要合并症之间无显著差异。胰岛素组患者的血浆胰岛素水平及HOMA-IR显著高于非胰岛素抵抗组。2.甲基化质谱检测结果显示,伴有胰岛素抵抗的冠心病患者的基因组ER-α第一外显子甲基化水平显著高于对照组。3.伴有胰岛素抵抗的冠心病患者的基因组ER-α甲基化水平随HOMA-IR的增加而增加。4.胰岛素抵抗组及非胰岛素抵抗组患者的基因组ER-α甲基化水平均随年龄的增加而增加,而非胰岛素抵抗组患者ER-α甲基化水平与年龄的相关性较胰岛素组更加显著。5.胰岛素抵抗组及非胰岛素抵抗组男、女患者之间的基因组ER-α甲基化水平无显著差异。研究结论比较伴有胰岛素抵抗或不伴胰岛素抵抗的冠心病患者的基因组ER-α甲基化水平,结果发现胰岛素组患者的基因组ER-α第一外显子甲基化水平显著高于非胰岛素抵抗组,且基因组ER-α甲基化水平随HOMA-IR的增加而增加。两组患者基因组ER-α甲基化水平均随年龄的增加而增加,胰岛素与基因组ER-α甲基化水平间的相关性随年龄的增加而降低,但在不同性别间无明显差异。