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柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)是我国新近发现的危害柠檬的重要病毒,目前对其致病机制的研究较少。本研究以1年生柠檬实生苗为寄主植物,对嫁接接种CYVCV和模拟接种的柠檬植株叶片分别进行了转录组及小RNA测序,利用生物信息学技术挖掘CYVCV侵染诱导差异表达的基因和miRNA,研究这些基因和miRNA在柠檬应答CYVCV胁迫中的功能。取得的研究结果如下:1.将接种后第30 d、60 d和90 d三个时间点收集的CYVCV侵染及对照柠檬植株叶片样品分别进行等量混合后进行转录组测序。测序结果显示,受CYVCV侵染的柠檬样品中有679个基因上调表达,637个基因下调表达,这些基因中分别有1114个和453个注释到GO功能和KEGG通路。GO功能主要集中在生物学过程和分子功能,其中细胞间信息传递、氧化还原过程、对真菌的防御反应、酶激活和酶抑制等功能富集最为显著。KEGG通路主要集中在代谢通路,其中光合作用、叶绿素生物合成与代谢、碳代谢和光合作用中的碳固定途径富集最为显著,共包含68个差异表达基因,推测这些代谢途径的基因表达量变化可能与柠檬受CYVCV侵染后叶片表现的叶片褪绿及黄化等症状相关。2.选取与光合作用、叶绿素生物合成与代谢以及碳代谢等通路相关的16个差异表达基因进行qRT-PCR分析,结果显示这些基因存在时间动态变化,其中有6个基因为先下调后上调表达,4个为先上调后下调表达。同时选取5个AGO同源基因和3个DCL同源基因进行qRT-PCR分析,结果显示有7个基因存在差异表达变化。分析这些基因的时间动态变化发现多数基因在第60 d的表达量变化明显与30 d和90 d不同。根据qRT-PCR结果筛选出6个差异显著的基因,分析其在CYVCV侵染的甜橙和小梾檬植株中表达量变化,结果显示同一基因在柠檬、甜橙和小梾檬植株中的表达模式相似。此外采用qRT-PCR方法对接种CYVCV的柠檬植株叶片样品进行检测,发现柠檬接种CYVCV后第30 d可检测到该病毒,至第60 d病毒含量最高而第90 d略有降低。3.从接种CYVCV(CY)和对照(MC)柠檬植株叶片样品中获得包含miRNA的Clean read各17 170 461条和18 472 346条,接种CYVCV和对照样品中分别有5 360 339条和6 043 365条read可比对到甜橙基因组。从2组样品共预测到159个miRNA,包括56个甜橙中已知的保守miRNA和103个从柠檬中新预测的miRNA。其中有13个保守的miRNA和20个新预测的miRNA受CYVCV侵染诱导差异表达。4.对20个新预测miRNA进行了miRNA茎环引物法RT-PCR扩增,其中12个扩增产物的序列与预测序列一致。测序结果显示,12个新鉴定的miRNA中,仅有两个下调表达,其余均为上调表达。差异表达的4个保守miRNA和4个新鉴定miRNA的qRT-PCR结果显示,miRNA的表达水平在接种CYVCV后第30 d至第90 d呈时间动态变化,其中保守miRNA均下调表达,新鉴定miRNA先下调后上调表达。以转录组测序数据作为参考,对25个差异表达miRNA进行靶基因预测,其中2个新鉴定miRNA和6个已知miRNA共预测到靶基因52个。靶基因功能分析表明,靶基因涉及应激反应和代谢等生物过程。此外,在甜橙基因组预测差异表达miRNA靶基因,靶基因功能分析表明,这些miRNA大部分与植物对非生物和生物逆境响应相关,保守miRNA靶基因的KEGG通路显示这些基因在植物逆境反应及光合作用和能量代谢相关通路中具有明显的富集现象。