背景:“十八反”是中医理论体系中配伍禁忌的重要内容,海藻甘草配伍作为其中的一对反药组合,古今医者对其能否应用于临床观点不一,部分医者认为海藻甘草被纳入配伍禁忌范畴,这是古人临床经验的总结,二者同用可能会对机体产生毒副作用;而一些医家则使用含有海藻甘草反药组合的方药治疗沉疴痼疾,且收获了良好的效果。为了解释二者能否同用这一问题,诸多研究者从临床应用、化学成分、药理毒理等方面进行分析探讨,其中实验部分绝大多数是单纯反药组合配伍应用在生理条件下进行的研究,然而探讨二者配伍禁忌的实质还需结合病理模型,本课题前期已经以海藻玉壶汤作为切入点,以甲状腺肿大病理模型为载体,研究海藻与甘草反药组合不同给药剂量、不同配伍比例、不同炮制品种对大鼠甲状腺肿大模型生物效应的影响,并得到了初步结果,本次实验将在前期研究的基础上继续进行探索。目的:本课题在前期实验研究的基础上,优选出治疗效果较好且没有明显毒性、含海藻甘草配伍的特定比例、特定剂量和不同炮制品种的海藻玉壶汤,进行下一步实验研究。实验中除设立海藻玉壶汤全方组外,还会在全方中去掉单味海藻、甘草或同时去掉海藻甘草反药组合,以期考察海藻玉壶汤所产生的“效”是否与反药组合有关,为揭示海藻与甘草配伍使用的科学本质提供依据。方法:①本课题在前期研究中已经对单味海藻、甘草,海藻甘草配伍以及海藻甘草在海藻玉壶汤中配伍应用进行了急性毒性实验研究,结果表明,海藻组、海藻炙甘草组LD50表现出一定毒性,属于小毒范畴。生甘草组、炙甘草组、海藻生甘草组、海藻玉壶汤(生甘草)和海藻玉壶汤(炙甘草)的LD50(n)的结果均未表现出毒性,应用较为安全。本次实验在选取海藻玉壶汤全方组的基础上,去掉其中一味或两味反药,进行急性毒性实验研究,一方面验证海藻玉壶汤(生甘草)和海藻玉壶汤(炙甘草)的前期实验结果,另一方面判断表现出的“毒”或“效”是否为反药配伍应用所致,或与其中的一味反药有关。预实验结果不满足于LD50计算条件时,选择LD50(n)进行实验。②在课题前期实验研究中,我们已经对海藻玉壶汤中海藻甘草反药组合不同比例、不同剂量、不同炮制品种的配伍宜忌条件进行了研究。在不同配比的实验中,配比四组即生甘草与海藻比例为4.84:2.08时,对甲状腺肿大的治疗效果较好,指标有向正常转归的趋势,对大鼠的肝脏、肾脏、心脏等功能没有明显的毒性反应,且4.84:2.08转换为人的剂量最接近药典的剂量范围,因此选择该比例进行后续实验研究;③在不同剂量的实验中,我们根据配比结果结合软件计算得到甘草与海藻在9:5.5时,应具有显著的生物学效应,所以根据该比例从高到低设定了四个剂量组,即剂量一27:16.5,剂量二9:5.5,剂量三3:1.8,剂量四1:0.61,经过实验研究,在甘草与海藻的比例为1:0.61时,治疗效果较好且没有明显的毒性,该剂量换算为人的用量是在《中国药典》规定范围之内,所以在后续的剂量实验中选择1:0.61进行研究;④在炮制品种的实验中,我们前期以甘草与海藻为9:5.5的比例对甘草的不同炮制品种在海藻玉壶汤全方中的应用进行研究,结果显示甘草的不同炮制品种应用于海藻玉壶汤对甲状腺肿大均有较好的治疗效果,指标有向正常转归的趋势,本次实验将在全方的基础上加减海藻甘草反药组合,继续进行研究。根据上述实验结果,我们将在选定的三个条件下,对海藻玉壶汤全方以及全方去掉其中一味或两味反药的配伍进行实验研究,在验证前期实验结果的同时,可以进一步确定实验结果所表现出的“效”或“毒”是否与反药组合有关。结果:1.急性毒性实验结果海藻玉壶汤(生甘草)组、海藻玉壶汤(炙甘草)组、海藻玉壶汤去甘草组、海藻玉壶汤去海藻(生甘草)组和去海藻甘草组分别在给药后第16、3、12、22、21天单组死亡数量达到半数,LD50(n)数值依次为71.08、68.28、55.78、72.27、79.62g生药/kg,海藻玉壶汤去海藻(炙甘草)组小鼠连续给药28d仍达不到半数致死量,以最大给药量作为最大耐受量,为80g生药/kg。实验结束后对小鼠的肝肾功能相关指标进行检测,均未表现出明显毒性。2.优选配比条件下海藻玉壶汤加减海藻甘草反药组合对甲状腺肿大大鼠模型效-毒关系的生物学效应及机制探讨(1)药效评价:海藻玉壶汤全方组、全方去海藻组、全方去甘草组以及全方去海藻甘草组的甲状腺系数较模型组明显降低,具有显著性差异(P<0.05);全方组、全方去海藻组和全方去海藻甘草组的T3水平较模型组有升高的趋势,但无统计学差异,全方去甘草组的T3水平较全方组明显降低,具有显著性差异(P<0.05);全方组的T4水平较模型组有升高的趋势,但无统计学差异,全方去海藻甘草组的T4水平较全方组明显降低,具有显著性差异(P<0.05);给药各组的TSH和TRH水平较模型组明显降低,具有显著性差异(P<0.05);给药各组的尿Ⅰ水平较模型组有升高的趋势,但无统计学差异。(2)毒性表征:肝脏功能:全方组、全方去海藻组、全方去甘草组以及全方去海藻甘草组对于大鼠肝脏系数较模型组有升高的趋势,但无统计学差异;全方组ALT的水平明显低于模型组,具有显著性差异(P<0.05),AST水平也较模型组明显降低,与全方去海藻组、全方去甘草组以及全方去海藻甘草组相比全方组的AST、ALT水平也有降低的趋势;全方组的ALB水平较模型组均明显降低,全方去海藻甘草组明显升高,均具有显著性差异(P<0.05),全方去海藻组和全方去甘草组的ALB水平较模型组有降低的趋势,但无统计学差异;全方组和全方去甘草组的TP水平较模型组明显升高,具有显著性差异(P<0.05)。肾脏功能:全方组的肾脏系数较模型组有升高的趋势,全方去海藻组、全方去甘草组和全方去海藻甘草组有降低的趋势,但均无统计学差异。全方去海藻组和全方去海藻甘草组的BUN水平较模型组和配比全方组明显升高,具有显著性差异(P<0.05);全方去甘草组的UA水平较模型组明显降低,具有显著性差异(P<0.05);全方去海藻组、全方去甘草组和全方去海藻甘草组的血Na+水平明显高于模型组,具有显著性差异(P<0.05),全方组有升高的趋势,但无统计学差异;全方去海藻甘草组的尿Na+水平较模型组明显降低,全方去海藻组的尿K+较模型组水平明显降低,具有显著性差异(P<0.05)。心脏功能:全方去甘草组和全方去海藻甘草组的心脏系数较模型组有升高的趋势,全方组和全方去海藻组有降低的趋势,但无统计学差异,全方去海藻甘草组与全方组比较心脏系数明显升高,具有显著性差异(P<0.05);全方去海藻甘草组的CK水平明显高于模型组以及全方组,具有显著性差异(P<0.05)。氧化应激:全方去海藻组的SOD水平较模型组明显升高,全方去海藻甘草组明显降低,具有显著性差异(P<0.05);给药各组的MDA和GSH-PX水平较模型组均有降低的趋势,但无统计学差异。(3)机制探讨:甲状腺方面:海藻玉壶汤全方组、全方去海藻组、全方去甘草组以及全方去海藻甘草组的TPOmRNA表达水平较模型组明显降低,具有统计学差异(P<0.05);给药各组的TgmRNA表达水平较模型组明显升高,具有显著性差异(P<0.05);全方组血清中Tg水平较模型组明显降低,具有统计学差异(P<0.05),全方去海藻组、全方去甘草组以及全方去海藻甘草组的水平有降低的趋势,但无统计学差异。肝脏方面:海藻玉壶汤全方组、全方去海藻组、全方去甘草组以及全方去海藻甘草组的CYP2E1mRNA表达水平较模型组明显降低,具有统计学差异(P<0.05);全方组、全方去海藻组和全方去甘草组的CYP3A1 mRNA水平较模型组明显升高,具有显著性差异(P<0.05);给药各组的CYP3A2mRNA的水平较模型组有升高的趋势,但无统计学差异。全方去海藻组、全方去甘草组的CYP2E1蛋白水平较模型组明显降低,具有统计学差异(P<0.05),全方组和全方去海藻甘草组也有降低的趋势,但无统计学差异。3.优选剂量条件下海藻玉壶汤加减海藻甘草反药组合对甲状腺肿大大鼠模型效-毒关系的生物学效应及机制探讨(1)药效评价:海藻玉壶汤全方组、全方去海藻组、全方去甘草组以及全方去海藻甘草组的甲状腺系数较模型组明显降低,具有统计学差异(P<0.05);给药各组T3、T4水平较模型组有升高的趋势,但无统计学差异;给药各组对TSH的水平有明显降低,具有统计学差异(P<0.05);全方去甘草组和全方去海藻甘草组的TBG水平较模型组明显升高,具有统计学差异(P<0.05);全方组的TRH水平较模型组明显降低,具有统计学差异(P<0.05),全方去海藻组、全方去甘草组和全方去海藻甘草组有降低的趋势,但无统计学差异。海藻玉壶汤全方组、全方去海藻组和全方去甘草组的尿Ⅰ水平较模型组明显升高,具有统计学差异(P<0.05)。(2)毒性表征:肝脏功能:全方去海藻组、全方去甘草组以及全方去海藻甘草组的ALT和AST水平较模型组明显降低,具有统计学差异(P<0.05),全方组的ALT和AST水平有降低的趋势,但无统计学差异;全方去甘草组的ALP水平较模型组明显降低,具有统计学差异(P<0.05);全方去海藻组的TP水平较模型组明显升高,具有统计学差异(P<0.05);全方去海藻组的ALB水平较模型组明显升高,全方去海藻甘草组明显降低,具有统计学差异(P<0.05);全方去甘草组和全方去海藻甘草组的GLB水平较模型组的水平明显降低,具有统计学差异(P<0.05)。肾脏功能:给药各组的肾脏系数较模型组有降低的趋势,但无统计学差异。海藻玉壶汤全方组的BUN水平较模型组明显升高,具有统计学差异(P<0.05),全方去甘草组和全方去海藻甘草组的UA水平较模型组明显降低,具有统计学差异(P<0.05),全方组和全方去海藻组有降低的趋势,但无统计学差异。给药各组的血Na+水平较模型组明显升高,具有统计学差异(P<0.05);全方去海藻组、全方去甘草组和全方去海藻甘草组的尿Na+水平较模型组有升高的趋势,但无统计学差异;全方组、全方去甘草组的尿K+水平较模型组明显降低,具有统计学差异(P<0.05),全方去海藻组和全方去海藻甘草组有降低的趋势,但无统计学差异。心脏功能:海藻玉壶汤全方组和全方去甘草组的心脏系数较模型组明显降低,具有统计学差异(P<0.05),全方去海藻组和全方去海藻甘草组有降低的趋势,但无统计学差异;全方组、全方去甘草组和全方去海藻甘草组的CK水平较模型组有降低的趋势,但无统计学差异;给药各组的LDH水平均有降低的趋势,但无统计学差异。氧化应激:海藻玉壶汤全方组、全方去海藻组和全方去海藻甘草组的SOD水平较模型组明显降低,具有统计学差异(P<0.05);全方组、全方去海藻组和全方去甘草组的MDA水平较模型组有升高的趋势,但无统计学差异。(3)机制探讨:甲状腺方面:海藻玉壶汤全方组、全方去海藻组、全方去甘草组以及全方去海藻甘草组的TPO mRNA水平较模型组明显降低,具有统计学差异(P<0.05);给药各组Tg mRNA水平较模型组明显升高,具有统计学差异(P<0.05);全方组、全方去海藻组血液中Tg水平较模型组明显降低,具有统计学差异(P<0.05),全方去甘草组和全方去海藻甘草组有降低的趋势,但无统计学差异;给药各组的TPOAb水平较模型组有降低的趋势,但无统计学差异。肝脏方面:海藻玉壶汤全方组的CYP2E1 mRNA水平较模型组明显降低,具有统计学差异(P<0.05),且较全方去海藻组、全方去甘草组和全方去海藻甘草组也明显降低,具有统计学差异(P<0.05)。给药各组的CYP3A1和CYP3A2mRNA水平较模型组有降低的趋势,但无统计学差异。全方组、全方去海藻组以及全方去甘草组的CYP2E1蛋白水平较模型组明显降低,具有统计学差异(P<0.05),全方去海藻甘草组有降低的趋势,但无统计学差异。4.含甘草不同炮制品种的海藻玉壶汤加减海藻甘草反药组合对甲状腺肿大大鼠模型效-毒关系的生物学效应及机制探讨(1)药效评价:全方组(生)、全方去海藻组(生)、全方组(炙)、全方去海藻组(炙)以及全方去甘草组的甲状腺系数较模型组明显降低,具有统计学差异(P<0.05);给药各组的T3水平均较模型组有升高的趋势,但无统计学差异;全方去海藻组(生)、全方组(炙)、全方去海藻组(炙)的T4水平较模型组有升高的趋势,但无统计学差异;全方去海藻组(生)、全方组(炙)、全方去海藻组(炙)以及全方去甘草组的FT3水平明显高于模型组,具有统计学差异(P<0.05),全方组(生)有升高的趋势,但无统计学差异;全方组(生)、全方去海藻组(生)、全方组(炙)以及全方去甘草组的TSH水平较模型组明显降低,具有统计学差异(P<0.05),全方去海藻组(炙)也有降低的趋势,但无统计学差异;全方去海藻组(生)、全方组(炙)、全方去海藻组(炙)以及全方去甘草组的TBG水平明显升高,具有统计学差异(P<0.05);全方组(生)和全方去甘草组的TRH水平较模型组明显降低,具有统计学差异(P<0.05),其他给药组有降低的趋势,但无统计学差异。(2)毒性表征:肝脏功能:全方组(生)、全方去海藻组(生)、全方组(炙)、全方去海藻组(炙)以及全方去甘草组的肝脏系数较模型组有升高的趋势,但无统计学差异;全方去海藻组(生)和全方去海藻组(炙)的ALT水平明显低于模型组,具有统计学差异(P<0.05)全方组(生)和全方组(炙)的水平有降低的趋势,全方去甘草组有升高的趋势,但无统计学差异;全方组(生)、全方去海藻组(生)、全方组(炙)、全方去海藻组(炙)的AST水平明显低于模型组,具有统计学差异(P<0.05);给药各组的ALP水平较模型组有降低的趋势,但无统计学差异;全方组(生)、全方去海藻组(生)、全方组(炙)的ALB水平明显低于模型组,具有统计学差异(P<0.05),全方去海藻组(炙)以及全方去甘草组有降低的趋势,但无统计学差异。全方去海藻组(生)的GLB水平较模型组明显降低,具有统计学差异(P<0.05)。肾脏功能:全方去海藻组(生)的肾脏系数较模型组有降低的趋势,全方组(生)、全方去海藻组(炙)以及全方去甘草组有升高的趋势,但均无统计学差异;给药各组的UA水平均明显低于模型组,具有统计学差异(P<0.05);给药各组的Cre水平较模型组有降低的趋势,但无统计学差异。给药各组的血Na+水平明显高于模型组,具有统计学差异(P<0.05),全方组(生)、全方去海藻组(生)、全方组(炙)和全方去海藻组(炙)的尿Na+水平较模型组有降低的趋势,全方去甘草组有升高的趋势,但无统计学差异;全方去甘草组的尿K+水平明显低于模型组,具有统计学差异(P<0.05)。心脏功能:全方组(生)、全方去海藻组(生)、全方去海藻组(炙)以及全方去甘草组的心脏系数较模型组有降低的趋势,全方组(炙)有升高的趋势,但无统计学差异;全方去海藻组(生)的CK水平较模型组明显降低,具有统计学差异(P<0.05),全方组(生)、全方组(炙)、全方去海藻组(炙)和全方去甘草组的CK水平有降低的趋势,但无统计学差异;全方去海藻组(炙)的LDH水平明显低于模型组,具有统计学差异(P<0.05),全方组(生)、全方组(炙)、全方去海藻组(炙)和全方去甘草组的LDH水平有降低的趋势,但无统计学差异。氧化应激:全方去海藻组(炙)和全方去甘草组的SOD水平明显低于模型组,具有统计学差异(P<0.05);给药各组的MDA水平较模型组有降低的趋势,但无统计学差异。给药各组的GSH-PX水平较模型组均有升高的趋势,但无统计学差异。(3)机制探讨:甲状腺方面:给药各组的TPO mRNA水平较模型组明显降低,具有统计学差异(P<0.05);给药各组的TgmRNA水平较模型组明显升高,具有统计学差异(P<0.05);全方去海藻组(生)和全方去海藻组(炙)的TPOAb水平较模型组明显降低,具有统计学差异(P<0.05),全方组(生)、全方去海藻组(炙)以及全方去甘草组有降低的趋势,但无显著性差异;全方组(生)和全方去甘草组血清中Tg的水平明显低于模型组,具有统计学差异(P<0.05);给药各组的TSHR水平较模型组均有升高的趋势,但无统计学差异。肝脏方面:全方组(生)、全方去海藻组(炙)和全方去甘草组的CYP2E1 mRNA水平明显低于模型组,具有统计学差异(P<0.05),全方去海藻组(生)和全方组(炙)有降低的趋势,但无统计学差异;全方组(生)、全方去海藻组(生)和全方组(炙)的CYP3A1mRNA水平较模型组明显升高,具有统计学差异(P<0.05),全方去甘草组有降低的趋势,但无统计学差异。全方组(生)、全方去海藻组(生)和全方去甘草组CYP2E1蛋白水平较模型组明显降低,具有统计学差异(P<0.05),全方组(炙)和全方去海藻组(炙)有降低的趋势,但无统计学差异。结论:①优选配比条件下,含反药配伍的海藻玉壶汤全方组对甲状腺肿大的恢复作用以及甲状腺各项指标回调效果优于全方去单味海藻、甘草或同时去掉海藻甘草的配伍组合,给药各组对大鼠肝脏、肾脏、心脏等方面均未表现出明显毒性。全方组所得的检测结果与前期实验基本相同。②优选剂量条件下,含反药配伍的海藻玉壶汤全方组对甲状腺肿大的恢复作用以及甲状腺各项指标回调效果优于全方去单味海藻、甘草或同时去掉海藻甘草的配伍组合,给药各组对大鼠肝脏、肾脏、心脏等方面均未表现出明显毒性。全方组所得的检测结果与前期实验基本相同。③含有甘草不同炮制品种的条件下,全方去海藻组(生)对于甲状腺肿的治疗作用以及相关指标的回调效果要好于全方组(生),全方组(炙)对于甲状腺肿的治疗作用以及相关指标的回调效果要优于全方去海藻组(炙)。全方组(生)和全方组(炙)所得的检测结果与前期实验基本相同。