背景肺癌是引起全世界肿瘤相关性死亡的主要原因,其引起的肿瘤相关死亡量比乳腺癌、前列腺癌和肠癌引起的死亡数量之和都多。非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC)约占肺癌患者的80%～85%,根据2004年世界卫生组织公布的肺癌组织学新分类,其中最主要的是4种类型的发生率依次为：腺癌31.5%、鳞癌29.4%、小细胞17.8%、大细胞癌9.2%。在肺癌驱动基因发现以前,晚期肺癌的治疗一直以为传统的含铂双药化疗为标准,从2004年EGFR突变基因的发现后,肺癌的治疗进入了靶向治疗时代,越来越多的驱动基因被发现,ALK融合基因、ROS1融合基因、c-MET基因等相继成为非小细胞肺癌靶向治疗的靶点基因。随着肺癌靶向治疗研究的深入,肺癌组织新分类也有了新的进展,在2013年2月11日出版的《临床肿瘤学杂志》(Journal of Clinical Oncology)杂志上,美国纪念斯隆凯特琳医院的William D. Travis博士等人发表了一篇述评文章,对最新版肺腺癌分类系统进行了探讨。除了根据肿瘤标志物进行病理诊断以外,还建议行相关靶点的分子基因检测,如EGFR、ALK, ROS1及c-MET等。在非小细胞肺癌中的功能研究实验及临床疗效均显示,驱动基因阳性的肺非腺癌(肺鳞癌、肺腺鳞癌)患者的靶向治疗疗效较肺腺癌者差。2011年一项合并分析研究数据指出,EGFR敏感突变阳性的肺鳞癌和肺腺鳞癌患者接受一代EGFR-TKI (Gefitinib)药物治疗时疗效差于肺腺癌,疾病反应率(RR)分别为27%和66%,疾病控制率(DCR)分别为67-70%和92-93%,中位无疾病进展期(mPFS)分别为3.0个月和9.4个月。2013年TCGA对人类12肿瘤类型的3299例标本进行全基因组测序结果进行汇总分析,最后通过基因改变进行整理分类,绝大部分癌症可归类为突变组(M组)或扩增组(C组),肺腺癌属于M组,分子事件变化以突变为主,肺鳞癌则是C组,分子事件变化以扩增为主。肺腺癌的单个基因点突变即可驱动肺癌的发生和发展,而肺鳞癌高通量测序结果揭示了肺鳞癌与肺腺癌完全不同的分子特征,肺鳞癌分子变化更加多样和复杂,为肺鳞癌患者靶向药物的开发增加了难度。这些研究结果同样也部分解释了肺腺癌患者接受EGFR-TKI治疗效果优于肺鳞癌的原因。众多的临床靶向治疗疗效观察发现,肺鳞癌的治疗疗效较腺癌差,且肺鳞癌目前仅有约7%的患者有EGFR突变和／或ALK融合,有机会接受靶向治疗。所以对大部分肺鳞癌患者而言,标准化疗仍然是治疗的主要手段,但与肺腺癌相比较,肺鳞癌对化疗的敏感性也较肺腺癌差。肺鳞癌的靶向治疗研究方面目前仍然落后于腺癌的研究。目前肺鳞癌中的研究较多的驱动基因主要有：FGFR1基因扩增,DDR2基因突变、PI3CA基因扩增和突变、PTEN基因缺失,相关靶向药物的研究仍在进行,目前暂且没有有效的靶向药物用于临床。所以说,寻找有益于肺鳞癌靶向治疗的驱动基因有着非常重要的现实意义。大细胞肺癌因其发病率低,专门针对大细胞肺癌的基因组学及相应的分子靶向研究更为稀少,现代医学对大细胞的认识非常粗浅,大细胞的个体化治疗亟待研究。本研究所通过基因和组织芯片等技术发现BCL11A(B Cell Lymphoma/Leukemia 11A)基因在非小细胞肺癌的癌组织中明显高于癌旁组织,在肺鳞癌和大细胞肺癌中的表达较肺腺癌高,且BCL11A的表达水平受到miR30a的调控。不仅如此,临床资料分析发现BCL11A基因是早期非小细胞肺癌患者术后无疾病生存期(DFS)独立预后因子。BCL11A基因又称CTIP1基因,与鼠的Evi9基因同源,属于B细胞淋巴瘤／白血病BCL11基因家族,在人类主要定位于2号染色体短臂2p16位点,能够编码C2H2锌指结构蛋白,为kruppel样转录因子,发挥转录抑制作用,与造血系统的淋巴瘤、白血病以及地中海贫血疾病之间的关系较密切,而与其他肿瘤之间的关系仍在进一步的研究中。由于转录过程中拼接的不同,产生三个亚型,根据结构大小命名为eXtra-Long (XL; 5.9 kb/125 kD), Long (L; 3.8 kb/100 kD) and Short (S, 2.4kb/35kD),不同的BCL11A亚型存在不同的功能及亚细胞定位。目前,众多的基础研究发现,BCL11A在B淋巴细胞及B细胞来源的淋巴瘤/白血病细胞的生长、增值和分化过程中发挥重要作用,被认为是原癌基因。值得关注的是,2015年1月在Nature杂志上由Khaled等研究者发表的文章,首次在三阴性乳腺癌(TNBC)中证明BCL111A基因的致瘤作用,同时也成为TNBC治疗的一个潜在靶点基因。与肺鳞癌相比,肺腺癌在非小细胞肺癌中发病率较高,而驱动基因的研究也相对比较透彻,其中发挥重要作用的三个驱动基因的阳性率分别为：EGFR基因突变率达49.8%,ALK基因融合阳性率为7.7%,ROSl基因融合为1.2%-1.7%。与EGFR和ALK基因相比,ROS1基因融合是肺腺癌的一个少见基因。ROS1基因作为酪氨酸激酶受体家族的一员,基因发生重排以后,使得酪氨酸激酶区持续处于活化状态,从而促进肿瘤细胞的生长和肿瘤形成。研究发现ROS1基因和ALK基因在激酶区的氨基酸有49%的同源性,细胞实验发现ROS1阳性的肺癌细胞株(HCC78)对ALK抑制剂克唑替尼治疗有效,且ROS1阳性的非小细胞肺癌患者同样对克唑替尼有效,临床试验数据显示患者的客观反应率(ORR)为56.0%,疾病控制率(DCR)为85.0%。同时多个有关ROSl基因的临床试验均表明,ROS1基因作为肺腺癌的一个少见基因,可指导临床用药及预测疗效。目的本研究主要对非小细胞肺癌患者中的两个少见基因与预测和预后作用进行研究。首先,在前期研究的基础上,以BCL11A基因三个蛋白亚型的结构以及功能不同为基础,对人类非小细胞肺癌组织中BCL11A基因进行蛋白分型分析。其次,针对亚型差异表达情况与临床数据结合进行预后生存分析。最后,收集部分接受克唑替尼治疗的ROSl阳性的非小细胞肺癌患者,对其临床疗效进行总结,指出ROSI基因对非小肺癌患者的预后和预测作用。第一部分非小细胞肺癌中BCL11A基因的三个蛋白亚型分析方法1.实验标本的选取选取前期免疫组织化学验证BCL11A蛋白表达阳性的非小细胞肺癌组织标本共40例,肺鳞癌共选取27例(27/40,67.5%),大细胞肺癌选取8例(8/40,20.0%),腺癌选取5例(5/40,12.5%)。选择的主要依据是BCL11A基因在蛋白和RNA水平在肺鳞癌及大细胞肺癌中的表达水平均较腺癌高,所以主要研究对象是肺鳞癌及大细胞肺癌。2.实验抗体的选择选择依据是根据三个亚型的大小以及亚细胞定位不同进行选择。(1)BCL11 A/123抗体(Active Motif公司),主要识别BCL11A蛋白亚型的637-835aa片段,而L和S两个亚型不具备该氨基酸片段,该抗体具有识别XL亚型的特异性,大量的文献实验结果也支持XL亚型验证。(2)Ab19487抗体(Abeam公司),主要识别172-434aa片段,为BCL11A-XL和L两个亚型共有的氨基酸片段,根据BCL11A-XL亚型结果,运用排除法可以确定二者的有无。另外一个原因是抗体Ab1987也是前期实验使用的抗体,为保证前后实验结果的一致性,所以选择该抗体。(3)Abl 8688抗体(Abeam公司),识别1-171aa片段,为三个亚型所共有,但是根据文献报道,BCL11A-XL和L亚型均分布于细胞核中,而S亚型主要存在于细胞质中,故根据蛋白定位可以识别S亚型的存在。(4)二抗选择带有辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠二抗和GFP标记的荧光二抗(GeneTex公司)。3.免疫组织化学实验3.1切片制备石蜡组织进行切片,厚约4-6微米,每例标本切取7张玻片,其中1张用作病理评估,3张做为实验阴性对照。3.2实验步骤(1)烤片：65℃处理2-3小时,目的是：保证切片充分固定,防止在实验修复过程中导致脱片,影响实验结果。(2)脱蜡及复水：常规二甲苯10min脱蜡3次→浓度梯度乙醇复水：100%、95%,90%,80%,70%各5min,自来水lmin。(3)抗原修复：高压抗原修复法,将玻片置于0.01M枸橼酸缓冲液(PH6.0)中煮沸(95℃)3min,流水冲洗冷却后经PBS清洗3次,每次5min。(4)去除内源性过氧化物酶：用浓度为3%H202室温下处理标本10min,然后PBS清洗3次,每次5min。(5)抗原封闭：室温下,滴加适量的正常羊血清工作液覆盖标本30min,弃去勿洗。(6)一抗孵育：实验组滴加适量浓度为(1：100)的一抗,同时对照组滴加等量的PBS,4℃过夜。第二天,室温复温30 min后进行PBS清洗3次,每次5min。(7)二抗孵育：实验组和对照组均滴加适量二抗,在室温下孵育30 min,后PBS清洗3次,每次5min。(8)DAB液显色：实验组和对照组均滴加适量的浓度为(1：50)的DAB显色剂,显微镜下密切观察反应,反应足够后用自来水冲洗来终止反应。(9)制片：苏木素复染5min,常规浓度梯度乙醇脱水：70%、80%、85%、90%、100%浓度各5min,二甲苯透明10min,干燥,封片。4.细胞免疫荧光实验4.1细胞的准备细胞的复苏和培养：将水浴锅预热至37℃,从液氮瓶中取出PC9细胞株或H1975细胞株的冻存管,快速置于37℃水浴中,不断地摇动,大约1-2min,使冻存管中的液体迅速融化。在无菌条件下把融化的细胞株从冻存管转移入离心管,离心弃上清制成细胞混悬液,滴加在培养板中,置于37℃的二氧化碳培养箱中培养。4.2实验步骤(1) 细胞固定和处理：从培养箱中取出的细胞要经过PBS液冲洗2次,轻轻吹打并弃去多余的培养基。滴加适量的中性甲醛固定10min,用PBS液清洗3次,之后滴加适量的羊血清进行抗原封闭,30min。(2) 一抗的孵育：用1%浓度的Triton试剂作为一抗的稀释剂,主要作用是在细胞膜表达打孔,有利于抗体进入到细胞内与细胞内的抗原进行特异性结合,抗体稀释的浓度为(1：100)。滴加适量的抗体与培养皿中,4℃过夜。PBS清洗3次,每次10min。(3) 荧光二抗的孵育：PBS液稀释荧光二抗至浓度为1：500,在密闭的暗室中滴加在培养皿中,在室温下反应1-2h,PBS清洗3次,每次10min。(4) DAPI染色：将培养皿中的PBS液小心吸干,滴加一滴DAPI试剂,反应3min后弃去用PBS液清洗3次,每次10min。该步骤要控制滴加DAPI试剂的量,加入太多易导致背景不干净,加入太少,细胞核染色不充分。(5) 封片观察：待培养皿中的液体吸干后,滴加少量的抗荧光淬灭封片剂,盖上盖玻片,以备观察。结果1.亚型免疫组化结果：40例非小细胞肺癌组织标本的亚型结果：(1)BCL11A-XL亚型主要在肺鳞癌和大细胞肺癌中表达,40例标本有19例(19/40,47.5%)阳性,其中肺鳞癌12例(12/19,63.2%),大细胞肺癌7例(7/19,36.8%),腺癌中未见有BCL11A-XL表达(p=0.006)。(2)BCL11A-L亚型在所有40例标本(100%)均为阳性,无组织学表达差异,且L亚型在细胞核和细胞质中均有表达。(3)蛋白水平无法区别BCL11A-L和S亚型。2.细胞免疫荧光结果：BCL11A-L蛋白在A549腺癌细胞株的核质均有表达,该结果与肺癌组织中检测的结果一致。第二部分BCL11A-XL亚型与非小细胞肺癌预后之间的关系分析方法1.分析对象根据第一部分的实验结果得知,BCL11A-XL亚型存在组织学差异表达,根据BCL11A-XL进行分组分析。从广东省人民医院电子病历系统查询患者的临床信息和治疗信息,并对患者的无病生存期(DFS)和总生存期(OS)进行随访,无疾病进展时间定义为从手术日期至手术复发转移时间,删失数据定义为截止最后随访时间疾病无复发或者失访；总生存期定义为从诊断时间至死亡的时间,删失数据定义为截止最后随访时间存活或者失访。2.分析方法应用SPSS13.0软件对实验结果进行统计分析,各组病例与临床参数性别、吸烟、PS、病理类型、疾病分期等的分析采用卡方检验,理论频数有小于5者采用Fisher确切概率法分析。年龄不符合正态分布,采用非参数的方法分析。用Kaplan-Meier法进行单变量生存分析,各因素水平间的比较采用Log-rank方法进行分析。用Cox回归方法分析预后相关因素,逐步回归的进入标准为p=0.05,排除标准为P=0.10。所有的p值都为双侧检验,以α=0.05为检验水准,p<0.05有统计学意义。结果1.基线资料分析40例患者临床资料分析：BCL11A-XL亚型表达结果与性别、年龄、疾病分期、TN分期无关,但与组织学类型(p=0.006)及吸烟状态有关(p=0.049),BCL11A-XL阳性吸烟者11例(57.9%),非吸烟者8例(42.1%),XL阴性吸烟者18例(85.7%),非吸烟者3例(14.3%)。2.生存预后分析本文入组的所有40例患者的无病生存期(DFS)及总生存期(OS)分析,结果如下：(1)所有患者中位无病生存期(mDFS)为54.4个月,中位生存期(mOS)为73.9个月。(2)BCL11A-XL阳性组和阴性组之间的mDFS和mOS均无明显统计学差异(p>0.1),截止至最后随访时间,阳性组只有36.8%的病人发生疾病复发和死亡事件。亚组分析显示,在肺鳞癌和大细胞癌患者中,BCL11A-XL阳性组的mDFS优于阴性的患者(χ2=5.32,P=0.021), mOS比较无统计学差异(P>0.1). (3) COX回归分析纳入年龄、性别、吸烟状态、疾病分期、淋巴结状态、组织学类型以及BCL11A-XL状态,其中BCL11A-XL表达是非小细胞肺癌患者DFS的独立预后因子(hazards ratio [HR] 0.246,95% confidence interval [CI] 0.065-0.939,p=0.040),但并不是非小细胞肺癌患者OS的独立预后因子。第三部分 ROS1基因在非小细胞肺癌中的预后和预测作用方法1.分析对象收集广东省人民医院肺癌研究所接受克唑替尼治疗的ROS1基因阳性的非小细胞肺癌病例,所有患者的ROS1基因均经过RT-PCR方法检测。从广东省人民医院电子病历系统查询患者的临床信息和治疗信息,对患者进行规律随访,对临床疗效进行规范评价。2.分析方法所有患者均接受标准的克唑替尼250mg每天,一天两次的治疗。临床疗效评价：通过RESIST 1.1标准进行评价的客观有效率(ORR)以及服药8周的疾病控制率(DCR)。结果1.基本资料2014年1月1日至2014年12月31日共有710例的非小细胞肺癌患接受ROS1基因检测,阳性率为2.0%(14/710),其中有6例患者服用克唑替尼(250mg, Bid)治疗。患者的中位年龄是48.5岁(33-57),所有的患者均无吸烟史,其中5例患者病理诊断为肺腺癌,1例为大细胞肺癌,所有患者ALK基因检测均为阴性。2.临床疗效6例患者接受克唑替尼治疗且均可进行疗效评价,疾病的客观有效率(ORR)为50%(3/6),3例患者均为服药4周后疗效评价为部分缓解(PR),服药8周的疾病控制率(DCR)为100%(3PR+3SD)。截止至2015年4月1日,共有2例病人因疾病进展而停止服药,其中有一例患者发生死亡。中位服药时间是22周(16-56)。结论1.IHC可检测到非小细胞肺癌中存在BCL11A-XL和L两种蛋白亚型,L亚型可在非小细胞肺癌的细胞核和细胞质中表达。2. BCL11A-XL蛋白亚型特异性的表达在肺鳞癌及大细胞肺癌中,且与吸烟呈负相关。3. BCL11lA-XL蛋白对早期肺鳞癌和大细胞肺癌的疾病复发发挥预测作用,是非小细胞肺癌患者的一个独立保护性的预后因子。4.ROS1基因可作为肺腺癌患者的治疗靶点,IHC方法检测可以指导临床治疗并预测临床疗效。