背景及目的:多指畸形是人类最常见的先天性肢体畸形之一,其特征是手指数目多于正常人。拇指多指畸形是一种最常见多指畸形,根据我国2012年中国出生缺陷防治报告统计,每年将有约3万左右的多指（趾）患儿出生,家族性多指的比例为4.8%,而散发型的占到95.2%,轴前（拇指侧）和轴后（小指侧）的多指畸形的比例分别为74.7%和25.3%。拇指在手部功能中占有重要作用,因此拇指发生多指畸形将对手部功能造成巨大影响。拇指多指畸形根据其畸形的严重程度可分为不同类型,轻者会影响手部外观,重者在影响手部外观的同时也会影响手的抓握功能。手部功能的丧失或减低会对个体在社会生活中造成巨大的影响,手部畸形的外观也会给患者及其家庭带来较大的心理负担。拇指多指畸形在胎儿阶段即可发生,由于常规的产前诊断主要以超声诊断为主,而胎儿在子宫内常呈握拳状态使得多指畸形的诊断存在难度,大多患儿的畸形是在出生后发现。多指畸形患者常在儿童早期通过外科手术治疗切除多余的手指,如果把握好手术时机,可以获得较好的重建拇指功能。目前伴随着社会的进步和发展,人们对于拇指多指畸形的治疗不仅局限于手部功能的要求,更侧重于重塑手部的精美外观,这也为外科医生带来巨大挑战。根据先天性多指畸形是否伴随有其他器官的症状,可大致分为综合征型和非综合征型,前者常伴有身体的其他器官的症状,比较常见的有:Greig Cephalopolysyndactyly综合征、Pallister-Hall综合征以及Ellis-van Creveld综合征等。非综合征型患者的多指畸形常独立发生,不伴有其他症状,根据多指的解剖结构可大致分为轴前多指,轴后多指以及复杂多指等。在遗传上已经证实多指畸形与多个基因突变有关,常见的包括FBLN1、HOXD13、LMBR1、FGFR2、GLI3和SHH等。查阅文献发现既往对多指畸形的研究多集中在遗传家系研究,对散发型病例几乎未见报道,目前非家族遗传的散发型拇指多指畸形在临床工作中最为常见,因此,为了进一步的探索非遗传的散发型拇指多指畸形（轴前多指）患者的基因突变类型、遗传学特征、分子病因学等,在本研究中,我们主要开展了以下几方面的工作。研究内容及结果:第一部分,通过吉林大学第一医院手足外科收集20名中国拇指多指畸形患者的临床信息。20名患者均为非综合征型拇指多指畸形（轴前多指）。发病类型:散发型,无家族遗传史。性别:男性13名,女性7名。年龄分布:6月-6岁。受累肢体:左拇多指畸形10人,右拇多指畸形10人。Wassel分型:II型1人,III型2人,IV型8人,V型3人,VI型3人,VII型3人。Temtamy-McKusick分型:PPD1型17人,PPD2型3人。所有患者抽取外周血,提取患者的DNA样本进行全外显子组测序（WES）分析。结果显示:通过全外显子组测序,筛选总变异位点数目668088个,通过保守（有害）性注释后获得的8312个预测有害突变位点进行基因功能及通路注释,对突变位点所在基因进行相关疾病数据库查询注释,从而获该突变位点与疾病相关的信息,通过数据库比对和文献查询我们确定了3名患者S4,S7和S20的基因突变:其中患者S4携带KIAA0586（NM₀14749）杂合突变p.S68T（dbSNP ID:rs147119902）和p.P772L（rs139493302）。患者S7携带GLI3基因中的杂合突变p.M948I（NM₀00168）,该突变位点既往文献未见报道。患者S20在EVC基因中携带2-bp缺失,这将导致移码（p.Q470fs）和EVC蛋白翻译的早期终止,该突变位点既往文献未见报道。这些突变均具有较低的次要等位基因频率（低于1%）,为评估错义突变在蛋白质水平上的影响,在7个物种中进行了蛋白质保守性分析,数据显示KIAA0586和GLI3中的错义突变影响高度保守的氨基酸,表明突变位点对蛋白质功能至关重要。之后对这些突变基因进行了Sanger测序确认突变在患者体内真实存在。由这些基因编码的蛋白质在纤毛以及SHH（Sonic hedgehog,音猬）蛋白信号通路中具有重要作用,以往研究发现SHH蛋白信号通路在胚胎发育时若出现异常或基因突变等,都会造成胚胎发育异常,其在多指畸形的形成过程中起着关键的作用。第二部分,通过文献查阅发现在脊椎动物中Hh信号通过GLI转录因子（GLI1、GLI2、GLI3）传导,其中GLI3在肢体发育中起主导作用。GLI3蛋白是Sonic Hedgehog基因信号通路的转录因子,GLI3以对Hedgehog依赖的方式定位于初级纤毛的顶端。肢体发育整个肢芽过程中SHH和GLI3的相互作用最终决定五个指的形成及其相应的形态特征。有文献报道拇指的形成需要Hoxa13直接调控GLI3的转录,Shh/GLI3信号系统和Hoxd转录因子在肢体发育过程中不断相互作用使得拇指形成。GLI3及其相关因子对拇指的形成起着极其重要的作用。在前面实验中我们通过外显子组测序发现GLI3基因中的新杂合突变p.M948I（NM₀00168）,通过生物信息学分析确认该基因突变,该突变未见文献报道,通过文献查阅认为该突变可能为形成拇指多指畸形的突变基因,为进一步明确GLI3基因新突变是否存在生物学意义,我们构建了GLI3的p.M948I点突变载体并转染小鼠胚胎成纤维细胞,进一步研究该突变基因对小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的影响和潜在的作用机制。首先分离培养原代小鼠胚胎成纤维细胞,并用Vimentin和α-SMA免疫荧光染色确认细胞纯度。随后应用分子克隆技术构建GLI3突变质粒转染小鼠胚胎成纤维细胞,提取GLI3基因突变细胞RNA,并进行转录组测序分析,通过RNA测序及生物信息学对序列进行分析,结果显示转染GLI3突变质粒后的小鼠胚胎成纤维细胞和野生型小鼠胚胎成纤维细胞比较,共有2452个基因上调,3047个基因发生了下调,差异表达分析结果发现,Cbx3基因显著上调。第三部分,Cbx3在小鼠胚胎成纤维细胞中的功能研究。构建Cbx3过表达质粒pcDNA-Cbx3,设计siRNA进行基因沉默,分别转染小鼠胚胎成纤维细胞,再进行CCK-8试剂检测小鼠胚胎成纤维细胞的增殖情况,用Transwell检测细胞侵袭能力的变化。结果发现在过表达Cbx3基因之后,细胞的增值率明显高于沉默组和对照组,且差异极显著,而在沉默Cbx3后,细胞的增殖能力比对照组还低,并且存在显著差异。在过表达Cbx3基因之后,细胞的侵袭数量明显多于对照组与沉默组,根据以上结果提示Cbx3基因在对小鼠胚胎成纤维细胞增殖及侵袭能力上均有促进作用。结论:通过本项目的研究,发现了可能导致散发型拇指多指畸形的新基因突变位点。并验证其中GLI3基因突变以后的功能,提示可能与上调Cbx3继而影响下游通路有关。本研究进一步明确了GLI3基因在肢体发育中的潜在功能,建立新的基因突变和多指畸形的联系,并初步阐明可能影响的信号通路,为后续进一步研究多指畸形病因奠定基础。