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研究背景:类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)以关节滑膜炎症为主要病理表现,是一种慢性、系统性和破坏性的自身免疫性关节疾病,其发病机制至今尚未完全阐明。在RA的疾病发生过程中,中性粒细胞发挥着重要的作用:中性粒细胞渗出血管并聚集到关节部位;中性粒细胞可通过释放细胞因子、蛋白水解酶等引起机体正常组织的损伤并可能延缓炎症反应的解决过程;细胞凋亡是中性粒细胞从RA炎症组织中清除并及时解决炎症必不可少的条件;中性粒细胞胞外诱捕网可促进瓜氨酸化自身抗原的产生,而抗-瓜氨酸蛋白抗原导致RA炎症的持续存在,并预示着疾病的更快进展和不良预后。因此,中性粒细胞是RA治疗的重要靶标。目前,临床常用的RA治疗药物主要是非甾体类抗炎药和改善病情的抗风湿药,如双氯芬酸、萘丁美酮、甲氨蝶呤、来氟米特等。中药制剂研究也较多,并且如雷公藤多苷在RA的临床治疗上也有显著疗效。丹参酮ⅡA(Tanshinone ⅡA,TⅡA),作为一种从中药丹参中提取的菲醌衍生物,在临床上用于很多疾病的治疗,如心绞痛、心肌梗死和脑卒中等。丹参酮ⅡA能够抑制多种组织和细胞的炎症反应,在无菌损伤诱导的斑马鱼验证模型中,丹参酮ⅡA可通过诱导中性粒细胞的凋亡并促进中性粒细胞的逆向迁移从而促进炎症的解决。但是丹参酮ⅡA是否能够通过调节中性粒细胞的活性治疗RA目前尚缺乏研究。目的:本研究用弗氏完全佐剂诱导小鼠关节炎模型,评价丹参酮ⅡA对佐剂诱导的RA小鼠的治疗作用及对体内中性粒细胞的调节作用,并检测丹参酮ⅡA对中性粒细胞功能的影响,为丹参酮ⅡA可以作为治疗RA的一个有效药物成分和日后的研究与临床应用提供实验依据。方法:(1)通过弗氏完全佐剂诱导的小鼠关节炎模型探讨丹参酮ⅡA对RA的治疗作用。(2)用免疫组织化学法检测RA小鼠踝关节髓过氧化物酶和中性粒细胞弹性蛋白酶的表达。(3)用小鼠气囊炎实验评价丹参酮ⅡA对中性粒细胞迁移的影响。(4)用实时荧光定量PCR、酶联免疫吸附实验以及免疫印迹实验检测促炎细胞因子 TNF-α、IL-6、iNOS 水平。(5)用Western Blot检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2,Bax和cleaved caspase-3的表达水平。用Annexin V/PI双染检测细胞凋亡。(6)用免疫荧光和共聚焦显微镜评估中性粒细胞胞外诱捕网的形成,髓过氧化物酶和中性粒细胞弹性蛋白酶的释放。结果:(1)丹参酮ⅡA可以缓解RA小鼠的症状:我们应用弗氏完全佐剂诱导小鼠关节炎模型检测丹参酮ⅡA是否可以抑制关节炎症。弗氏完全佐剂诱导的模型组小鼠与正常对照组小鼠相比,踝关节肿胀程度、踝关节直径和关节炎评分均明显增高。腹腔注射丹参酮ⅡA的治疗组小鼠关节肿胀程度明显减轻,踝关节直径和关节炎评分则显著下降(P<0.01)。(2)RA小鼠踝关节组织学分析:我们发现弗氏完全佐剂诱导RA模型组小鼠踝关节与正常对照组相比出现典型的炎症表现,如软骨的损伤、滑膜增生和大量的炎性细胞浸润。丹参酮ⅡA治疗组小鼠的关节病理变化则得到明显改善,软骨的损伤、滑膜增生得到缓解,炎性细胞浸润减少。(3)丹参酮ⅡA对RA小鼠血清中TNF-a和IL-6分泌的影响:经ELISA法检测,小鼠血清中的TNF-a和IL-6的含量,RA小鼠与正常对照组相比有明显升高。而经丹参酮ⅡA治疗后,其含量显著降低(P<0.05)。(4)丹参酮ⅡA对小鼠踝关节中MPO和NE表达的影响:经免疫组织化学分析,RA小鼠踝关节中MPO和NE的表达与正常组小鼠相比明显增多。然而,丹参酮Ⅱ治疗组MPO和NE的表达与RA模型组小鼠相比则明显减少。(5)丹参酮ⅡA对小鼠中性粒细胞募集的影响:通过小鼠气囊炎实验,收集气囊灌洗液,经细胞计数,我们发现LPS刺激组的白细胞总数和中性粒细胞数量与PBS组相比显著增多(P<0.01),而经丹参酮ⅡA处理后白细胞总数和中性粒细胞数量与LPS刺激组相比则明显减少(P<0.01)。(6)丹参酮ⅡA对中性粒细胞TNF-α、IL-6的影响:用实时荧光定量qPCR和ELISA法分析丹参酮ⅡA是否能够降低经LPS激活的中性粒细胞中TNF-α、IL-6的表达。我们发现,不同浓度(5μM、10μM、25μM)的丹参酮ⅡA处理组与LPS刺激组相比,TNF-α、IL-6的表达均呈有一定程度的抑制,并且随丹参酮ⅡA应用浓度增大,抑制作用更明显,其中浓度为10μM和25μM时具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。(7)丹参酮ⅡA对中性粒细胞iNOS的影响:分别用实时荧光定量qPCR和Western Blot检测了丹参酮ⅡA对经LPS激活的中性粒细胞中iNOS mRNA和蛋白的表达。我们发现,丹参酮ⅡA处理组与LPS刺激组相比,iNOS mRNA和蛋白的表达均被抑制,并且具有统计学意义(P<0.05)。(8)丹参酮ⅡA对中性粒细胞凋亡的影响:用Western Blot检测了 Bcl-2,Bax和cleaved caspase-3蛋白的表达情况,我们发现丹参酮ⅡA处理组与LPS 激组相比,可以明显增加Bax和cleaved caspase-3的表达(P<0.05)。但Bcl-2作为典型的抑制细胞凋亡的信号,丹参酮ⅡA可以使其表达明显减少(P<0.05)。流式结果同样证明了丹参酮ⅡA可以促进中性粒细胞的凋亡。(9)丹参酮ⅡA对中性粒细胞NETs形成和MPO、NE释放的影响:通过间接免疫荧光染色后,用激光共聚焦显微镜观察,我们发现,与PMA刺激组相比,丹参酮ⅡA可以明显抑制中性粒细胞NETs的形成以及MPO、NE的释放。结论:(1)丹参酮ⅡA可以抑制中性粒细胞向RA炎症部位的迁移和聚集。(2)丹参酮ⅡA可以减少TNF-α、IL-6、iNOS的表达,从而抑制中性粒细胞活化。(3)丹参酮ⅡA可以促进活化的中性粒细胞适时地凋亡,以促进RA炎症的解决。(4)丹参酮ⅡA可以抑制NETs的形成和NETs的形成过程中MPO、NE的释放,从而减轻RA的炎症反应和组织损伤。这些结果表明丹参酮ⅡA可以作为治疗RA的一个有效的药物成分,并且为日后的研究与临床应用提供实验依据。