研究背景NK/T细胞淋巴瘤(Natural killer/T cell lymphoma,NKTCL)是一种较为罕见的非霍奇金淋巴瘤的亚型。这种淋巴瘤通常发生在鼻和鼻旁等上呼吸道区域,约有20%的病例可能发生在其他组织,包括皮肤、软组织、胃肠道和睾丸。虽然大多数NK/T淋巴瘤病例在疾病早期已被诊断,但是其对于常用联合化疗方案的反应率较差,长期生存率仅为46%-60%,如何解决NK/T细胞淋巴瘤患者较差的预后仍旧是世界性难题。通常认为肿瘤是由渐进性的遗传异常驱动的一种疾病,其发生发展过程较为复杂,涉及多基因参与、多因素影响以及多阶段的变异积累。有关NK/T细胞淋巴瘤的发生机制仍存在争议。有研究称,NK/T淋巴瘤与EB病毒(Epstein-Barr Virus,EBV)感染密切相关。目前仍需要大量有关于NK/T淋巴瘤的研究来探究解释该疾病的发病机制,尤其是分子发病机制。全外显子测序,又称作靶向外显子捕获,是一种通过研究人类基因组编码区而探索与疾病有关基因的新技术。与全基因组测序相比,全外显子测序仅占人类全基因组的1%,在研究致病基因的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms,SNP)和插入(Insertion,Ins)和缺失(Deletion,Del)标记等方面显示出了明显的优势。新一代测序技术的应用进一步确定了NK/T细胞淋巴瘤基因变化的复杂性。国际上报道较多的测序结果包括,染色体6q的缺失,以及在该染色体上常见缺失片段中的抑制基因PRMD1、FOXO3、HACE1和PTPRK。已知发生突变的肿瘤相关基因包括RNA解旋酶基因DDX3X、肿瘤抑制基因TP53、JAK-STAT途径分子基因STAT3和STAT5B等,揭示NK细胞恶性肿瘤与细胞凋亡、细胞间粘附分子、细胞外基质受体相互作用、信号转导通路密切相关。研究显示,表观遗传改变在肿瘤发生发展过程中起到关键作用。表观遗传改变是指不引起基因序列改变但却影响基因表达的可遗传变化。在肿瘤形成的早期,癌前细胞的表观遗传改变决定了随后的遗传改变,从而促使癌前细胞克隆恶变。表观遗传畸变在NK/T细胞淋巴瘤中也很普遍,参与表观遗传途径的基因包括MLL、ASXL1、ARID1A和EP300等。其中以混合谱系白血病2(Myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia 2,MLL2)基因的突变率最高。MLL2基因是众多组蛋白甲基转移酶编码基因之一,在肿瘤的发生发展中起到了关键作用。组蛋白甲基转移酶参与影响DNA和组蛋白紧密程度,且在基因印记、异染色质形成和基因转录调控的过程中起到关键作用。据研究报道,MLL2基因在滤泡型淋巴瘤中的突变率为89%,且是众多突变基因中突变率最高的。而在弥漫大B细胞淋巴瘤中的突变率为32%。有研究在乳腺癌和大肠癌细胞的细胞核与细胞质中发现了表达明显升高的MLL2蛋白,其表达水平与肿瘤的恶性程度呈现正相关的趋势。所以,在肿瘤的发生发展过程中,MLL2基因起到什么作用均有待于进一步研究检验。鉴于MLL2基因在NK/T细胞淋巴瘤中有较高的突变率,探讨MLL2基因及其易感位点对NK/T细胞淋巴瘤的发生、发展、耐药以及预后影响,对于疾病的认识及提高疾病治愈率具有重大的意义。由于NK/T细胞淋巴瘤的发病率较低且肿瘤组织较难获取,以及全外显子测序的费用较高,对其的测序研究大多限于小样本研究,目前仍需要更多的研究来进一步探讨及验证相关问题。本研究利用全外显子测序技术获得了NK/T细胞淋巴瘤的外显子基因组信息,并提出了涉及该疾病相关的新基因MLL2,分析了其突变的相关信息,进而探讨其突变是否对患者临床指标及预后产生影响,希望对NK/T淋巴瘤的临床诊断及治疗提供有用信息以及新思路。目的探索NK/T细胞淋巴瘤中MLL2的基因突变特征,及其与患者临床指标和预后之间的关系。材料与方法1.研究对象:本研究纳入的91例NK/T细胞淋巴瘤病例均来自本院河南省淋巴瘤国际合作实验室2010年1月至2016年12月淋巴瘤临床信息和生物样本资料库。所有患者均经术后病理诊断为NK/T细胞淋巴瘤。从其病理组织所在医院收集相应的癌组织病理蜡块,切取蜡卷(每卷厚度10μm),并置于负20摄氏度冰箱保存。取患者外周血作为正常组织对照,外周血取自河南省淋巴瘤国际合作实验室的生物样本库,置于负80摄氏度冰箱保存。最终纳入本研究的91例病例中,年龄跨度为8-76岁,其中男性67例,平均年龄45岁,女性24例,平均年龄42岁。2.研究方法:对外显子测序分析组91例NK/T细胞淋巴瘤患者进行石蜡肿瘤组织和外周血DNA提取,获得DNA后,进行电泳、DNA浓度的测量以及标化,使其符合外显子测序的标准。进行测序后对结果进行分析。记录入选病例的详细基本信息、临床和随访资料,包括患者的性别、年龄、分型、ECOG评分、Ann Abor分期、Ki 67表达、血清LDH值、IPI评分、B症状、β2微球蛋白数值、血沉、随访截止日期、总生存期(Overall survival,OS)、无进展生存期(Progression-Free-Survival,PFS)、治疗方法及疗效评价等。本研究采用SPSS21.0对数据进行统计学分析。资料描述采用率及构成比,关联性分析采用Spearman秩相关。组间差异比较采用卡方检验。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,对生存率进行估计。应用log-rank法检验生存结果的显著性。预后因素的分析采用Cox多因素回归分析。如果P<0.05水平,说明结果有统计学意义。生存曲线做图采用Graphpad Prism 5软件。研究结果1.整体突变共发现130217个突变事件,其中包括117976个SNP(90.6%),7005个Ins(5.38%)和5236个Del(4.02%)。在91例NK/T细胞淋巴瘤中,17例出现MLL2基因突变,突变率为18.68%。共发现24个突变事件,其中包括个19个SNP、1个Ins和4个Del。在19个SNP中,按照发生率由高至低的顺序,错义突变12个错义突变(63.16%)、3个无义突变(15.79%)和4例剪切位点的突变(21.05%)。纳入的病例其MLL2基因的突变主要发生在10、24、29、30、31、32、34、39、42、47、48、49号外显子。全外显子测序和MLL2测序结果之间并无明显的相关性(P=0.200)。2.根据患者是否有MLL2突变,分为2组,突变组有17例,占18.68%;MLL2野生组74例,占81.32%。其中,MLL2突变组与野生组在Ann Abor分期、Ki 67分组中的分布差异具有统计学意义(P<0.05)。在其余分组中的分布如性别、年龄、分型、ECOG评分、血清LDH值、IPI评分、B症状、β2微球蛋白和血沉均无统计学差异(P>0.05)。3.对于PFS,通过对91例NK/T细胞淋巴瘤患者的分析,仅有Ann Abor分期与患者的PFS率上存在显著统计学差异(P<0.05),而其他因素如性别、年龄、分型、ECOG评分、血清LDH值、IPI评分、Ki 67表达、B症状、β2微球蛋白和血沉与PFS率均无统计学差异。4.对于OS,MLL2、ECOG评分、Ann Abor分期、IPI评分、Ki 67表达与患者总生存率上有显著差异,性别、年龄、分型、血清LDH值、B症状、β2微球蛋白和血沉与OS率无明显统计学差异。MLL2野生组比突变组预后较差(χ~2=4.682,P=0.031),差异具有统计学意义。5.将单因素分析得出有统计学意义的变量因素和临床上可能影响预后的因素纳入OS的多因素COX比例风险模型。结果显示,MLL2、ECOG评分、IPI评分、Ki 67表达与预后无关。只有Ann Abor分期是NK/T细胞淋巴瘤独立的影响预后的因素。5结论1.MLL2基因在NK/T细胞淋巴瘤中存在高频突变。2.MLL2基因突变与NK/T细胞淋巴瘤患者的Ann Abor分期、Ki 67表达程度相关。3.MLL2基因突变可能作为影响NK/T细胞淋巴瘤患者生存的独立预后因素之一。