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目的：
白血病是一种造血系统的恶性病变,其主要表现为异常的白血病细胞及其幼稚细胞在骨髓及其他造血组织中进行性的异常增生,发病机制目前尚不完全明确。
泛素.蛋白酶体系统(UPS)是真核生物体内进行蛋白选择性降解的主要通路。由UPS介导的蛋白质降解通路的严密调控在细胞周期中蛋白质半衰期的调控、转录调控、抗原提呈、血管发生、以及移除错误折叠或受损的蛋白质等过程中均发挥重要作用。研究表明,蛋白酶体抑制剂通过对泛素化通路的阻断可诱导多种包括白血病的人类肿瘤的细胞凋亡,是一类很有发展前途的抗肿瘤药物。
由于人工合成的化疗药物在治疗肿瘤方面存在局限性,近年来一些从植物中提取的天然抗肿瘤药物得到了科研界、医疗界的广泛关注。白藜芦醇是富含于葡萄皮、花生、红酒等中的一种天然多酚类化合物,白藜芦醇在抗肿瘤、抗炎、肝脏保护、神经保护、心血管保护和免疫调节等方面均发挥重要作用。已有大量报道表明,单独应用大剂量(通常大于50μmol/L)的白藜芦醇能够抑制人类肿瘤细胞的生长。另外已有报道,白藜芦醇联合某些化疗药物治疗肿瘤,不仅能够降低化疗药物的毒副作用,而且能够增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。本研究探讨蛋白酶体抑制剂单独及联合白藜芦醇在白血病细胞凋亡过程中的影响作用。
方法：
1、单独使用MG132或联合白藜芦醇处理白血病细胞
2、MTT法检测细胞活力
3、流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期
4、蛋白印迹法检测蛋白PARP剪切水平
5、实时定量PCR和蛋白印迹法检测p27Kipl和FOXO1的表达水平
6、染色质免疫沉淀法检测结合到p27Kipl启动子的FOXO1水平
结果：
一、白藜芦醇能够对抗MG132对K562的细胞毒性效应
MTT结果显示1-20μmol/L的白藜芦醇对K562细胞活力无影响,而大于50μmol/L能使细胞活力明显下降;K562细胞活力对MG132呈剂量依赖性下降;白藜芦醇能够对抗MG132呈剂量依赖性诱导的细胞活力变化,2μmol/L具有明显的抑制效应,5-20μmol/L显示出最大效应;即使选用毒性剂量(50-100μmol/L)的白藜芦醇仍然能够有效对抗MG132的细胞毒性。AnnexinV/PI双染证实MG132能够明显诱导K562细胞凋亡,100μmol/L白藜芦醇单独处理K562细胞24h仅诱导了12%的细胞凋亡;联合白藜芦醇能够明显对抗MG132诱导的细胞凋亡。WesternBlot显示,联合白藜芦醇能够明显的抑制由MG132诱导的PARP剪切成89kDa片段。
二、白藜芦醇能够降低蛋白酶体抑制剂对白血病细胞的毒性效应
流式AnnexinV/PI双染结果显示,白藜芦醇同样能够对抗MG132对NB4,U937,Daudi和Raji细胞凋亡作用,三种不同结构的蛋白酶体抑制剂(PSI,lactacystin,epoxomicin)能够诱导K562细胞凋亡40-60%;同时5μmol/L白藜芦醇对三种不同结构的蛋白酶体抑制剂都有明显的对抗作用。
三、白藜芦醇对抗MG132诱导的细胞毒性效应过程中涉及到p27Kipl介导的G1/S阻滞
使用5μmol/L白藜芦醇、5μmol/LMG132分别处理K562,NB4,U937,Daudi和Raji细胞24h后,流式PI单染结果显示前者S期细胞数增加,后者S期和G2/M期细胞数均增加。与MG132单独作用相比,联合白藜芦醇之后S期细胞数降低,而G1期细胞数增加。Westernblot显示,与对照组相比,白藜芦醇、MG132单独作用于K562细胞,均增加了p27Kipl的表达,二者联合使用时更多地增加了p27Kipl的表达。与对照组相比,敲低p27Kipl后微弱地对抗了MG132单独诱导的细胞凋亡,重要的是,在p27Kipl敲低细胞中白藜芦醇对MG132作用的拮抗明显削弱。四、白藜芦醇和MG132通过FOXO1诱导p27Kipl上调
实时定量PCR显示,单独使用白藜芦醇促进mRNA水平p27Kipl表达增加,而MG132对其无明显作用。两者联合使用,更能显著地增加mRNA水平p27Kipl的表达。首先用RNA合成的抑制荆放线菌酮D预处理细胞,然后使用白藜芦醇单独或联合MG132,结果显示放线菌酮D在两种处理方式中完全阻滞了p27KiplmRNAT水平的上调。实时定量PCR和Westernblot结果显示,与vehicle或MG132处理组相比,白藜芦醇单独或联合MG132处理组都能明显增加FOXO1的表达。ChIP实验发现与单独使用白藜芦醇相比,白藜芦醇联合MG132处理后结合到p27Kipl启动子的FOXO1明显增多。采用siRNA敲低FOXO1后,Westernblot结果显示明显抑制了白藜芦醇诱导的FOXO1表达。重要的是,由白藜芦醇诱导的p27Kipl的表达也明显被抑制。
结论：
1、白藜芦醇可能通过调节FOXO1的转录活性和p27Kipl的募集从而对抗蛋白酶体抑制剂的细胞毒性效应。
2、需要通过体内临床试验来验证此结论,从而告知患者在使用蛋白酶体抑制剂做化疗时避免摄取白藜芦醇的相关产品。