研究背景膳食脂肪酸是人和哺乳动物重要的营养物质,是调控机体糖脂代谢稳定的重要影响因素。肝脏是脂肪酸主要的代谢场所,由于摄入膳食脂肪酸的种类、比例以及总量的不同,肝脏中的脂质组分和糖脂代谢相关基因的表达也会存在差异。研究显示,摄入过量的脂肪酸可以诱导肥胖、糖尿病和非酒精性脂肪肝等代谢疾病的发生。目前,已有诸多研究对脂肪酸如何调节糖脂质代谢这一问题进行过一系列的探讨。然而,在预防糖脂代谢异常方面,脂肪酸在肝脏中如何调节糖脂代谢相关基因的表达这一问题鲜有报道。为此,本研究将探讨不同种类、浓度和不同混合比例的脂肪酸对肝细胞糖脂代谢相关基因表达的影响。由于在体外研究肝细胞脂代谢中,一方面发现,脂肪酸作为脂溶性物质,需要溶于水溶性物质或与水溶性载体结合才能进入并作用于靶细胞,而水溶性物质或载体的种类较多,采用哪一种目前尚没有具体的定论；另一方面发现,以肝细胞株作为脂代谢模型的种类也较多,具体选择哪一种细胞株也尚不明确,那么本研究首先对脂肪酸溶剂和肝细胞株进行筛选,为接下来的脂代谢研究选择合适的脂肪酸溶剂和细胞株。第一部分不同溶剂中油酸LO2和HepG2细胞生长和胞内甘油三酯含量的影响目的探讨以二甲基亚砜(DMSO)和牛血清白蛋白(BSA)分别溶解的油酸(OA)对人正常肝细胞(L02)株和人肝癌细胞(HepG2)株的影响,寻找合适的脂肪酸溶剂以及体外研究脂代谢的肝细胞系。方法L02和HepG2细胞均分为：空白对照组,DMSO组,DMSO容解的油酸组,BSA组,BSA溶解的油酸组。各组细胞分别培养24h、48h后,采用MTT法检测细胞活力,油红O染色法观察活细胞数目和胞内脂滴变化；甘油-3-磷酸氧化酶法检测细胞内甘油三酯(TG)的含量。结果(1)以DMSO为溶剂：L02细胞中,DMSO组的细胞存活率在24h时均显著高于空白对照组(P<0.05),随着时间的延长(48h),细胞存活率均低于空白正常组,尤其在高浓度(0.8%)时显著降低(P<0.05)；DMSO溶解的油酸组中,在24h时,随着浓度的升高,细胞存活率先升高,在6.4μg/ml时下降,低于空白对照组,但差异没有统计学意义；随着培养时间的延长,各组中细胞存活率相应降低,且在3.2和6.4μg/ml时显著降低(P<0.05)。HepG2细胞中,DMSO组的细胞存活率在24h时与空白对照组比较均没有显著变化,随着时间的延长,细胞存活率均相应降低,尤其在0.4%和0.8%时显著降低(P<0.05)；DMSO溶解的油酸组中,24h时,在0～3.2μg/ml浓度范围内,细胞存活率与空白对照组比较没有显著的变化,在6.4μg/ml时,存活率开始显著下降(P<0.05),随着培养时间的延长,各油酸组的细胞存活率也相应降低并均显著低于空白对照组(P<0.05);(2)以BSA为溶剂：在L02细胞中,24h时,BSA组的细胞存活率高于空白对照组,但差异没有统计学意义；随着培养时间的延长(48h),细胞存活率显著升高,高于空白对照组(P<0.05)；在BSA溶解的油酸组中,细胞存活率在24h时随着浓度的增加而显著升高(P<0.05)；48h时,各组细胞存活率均相应的升高,且均显著高于空白对照组和BSA组(P<0.05)。HepG2细胞中,在24h时,BSA组的细胞存活率与空白对照组的差异没有统计学意义,随着时间的延长,细胞存活率升高,显著高于空白对照组(P<0.05)；BSA溶解的油酸组的细胞存活率在24h时均显著高于空白对照组和BSA组,随着培养时间的延长,细胞存活率相应的升高,且只有6.4μg/ml组的细胞存活率显著高于BSA组(P<0.05)。(3)油红O染色显示,各组细胞的活细胞数目的变化趋势与MTT结果一致；在DMSO溶解油酸培养细胞24h后,与相应空白对照组比较,L02和HepG2细胞胞内脂滴随着浓度的升高而呈增多趋势,尤其是L02细胞增多明显；随着培养时间的延长,两细胞胞内脂滴均相应增多。在BSA溶解下,在24h时,与空白对照组比较,L02细胞胞内脂滴在高浓度时增多,随着时间的延长,L02细胞脂滴明显增多,而HepG2细胞胞内脂滴均没有没有明显的变化。(4)各组细胞内TG含量变化趋势与油红O染色结果类似,以L02细胞更为敏感。结论在本研究范围中,作为OA的溶剂,BSA较DMSO合适：L02较HepG2细胞更合适作为体外研究脂代谢的细胞株。第二部分外源脂肪酸对L02细胞功能和脂质代谢相关基因表达的影响目的以软脂酸(PA)、油酸(OA)、二十二碳六烯酸(DHA)分别作为饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的代表,探讨不同浓度和不同比例的游离脂肪酸对人正常肝细胞L02功能和脂代谢相关基因表达的影响。方法实验分为单种脂肪酸处理组和混合脂肪酸(PA/OA/DHA)处理组：在预实验基础上确定三种脂肪酸(PA、OA、DHA)单独处理细胞的终浓度均分别为0、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4和12.8μg/ml。依据单种脂肪酸处理L02细胞存活率结果,确定3.2和12.8μg/ml为混合脂肪酸组的两个终浓度,PA/OA/DHA比例分别为1：2：1、1：1:1、1：1：2。利用MTT法观察细胞的存活率,初步确定各脂肪酸浓度范围。用分光光度法检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)、天门冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)活性；甘油-3-磷酸氧化酶法检测细胞内甘油三酯(TG)的含量；反转录PCR (RT-PCR)技术检测过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR-γ)、肝X受体α (LXRa)、固醇调节元件结合蛋白(SREBP-1c)、低密度脂蛋白受体(LDLR)、载脂蛋白C-I (apoC-I)基因mRNA表达量。结果(1)游离脂肪酸PA、OA、DHA分别孵育L02细胞24h后,在0～3.2μg/ml浓度范围内,细胞存活率均呈上升趋势；且在3.2μ.g/ml,三种单脂肪酸处理的细胞存活率基本一致。浓度超过3.2μ.g/ml后,OA作用下细胞存活率仍呈陡峭上升趋势,而PA、DHA作用下的细胞存活率则呈下降趋势,当浓度达12.8μg/ml时,PA、OA、DHA三组的细胞存活率(31.7±5.8、303.9±14.2、4.9±0.7)呈现极大差异(P<0.05)。终浓度分别为3.2和12.8μg/ml的不同比例的混合脂肪酸中,与空白对照组相比,细胞存活率均有上升趋势；且3.2μg/ml混合处理亚组与相同浓度上述三种脂肪酸单独处理时细胞存活率基本一致,而12.8μg/ml混合组的三种不同比例亚组的细胞存活率均显著高于同浓度下的PA和DHA亚组,但显著低于OA亚组。(2)在0～12.8μg/ml浓度范围内培养LO2细胞24h后,结果显示：随着OA浓度增加,胞外AST和LDH水平呈下降趋势。PA和DHA浓度超过6.4μg/ml后胞外LDH、AST和ALT水平均显著升高。在3.2μg/ml组的混合脂肪酸中,与同等剂量的单种脂肪酸相比,三种不同比例混合的脂肪酸处理后AST水平均有所下降,而LDH水平则均显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。在12.8μg/ml的浓度下,三种不同比例混合的脂肪酸处理后胞外LDH和AST水平均低于同等剂量单独处理的PA和DHA亚组；1：2：1和1：1：1亚组的ALT水平尽管比同等剂量PA和DHA处理后有所下降,但仍高于空白对照组。(3)在单种脂肪酸组和混合脂肪酸组中,细胞胞内的TG含量均显著增加(P<0.05),其中DHA浓度的升高,胞内TG含量增加最为显著。(4)与空白对照组比较,除了3.2μg/ml的1：1：1组和12.8μg/ml的1：1：2组的PPAR-γ mRNA显著降低(P<0.05)外,PPAR-γ mRNA表达均上调；除了12.8μg/ml下的DHA组和1：2：1组,其他各脂肪酸组中LXRα、LDLR和apoC-I mRNA表达均呈下降趋势；除了12.8μg/ml下的DHA组外,其他各组中SREBP-1c mRNA的表达也均呈下降趋势。结论本研究中,脂肪酸的种类、浓度和比例在LO2细胞正常功能和脂代谢相关基因表达中均起着重要的作用。与其他脂肪酸不同,高浓度的DHA能促进胞内脂质的合成并均上调脂代谢相关基因(PPAR-γ、LXRα、SREBP-1c、LDLR和apoC-I)的表达；在预防脂代谢紊乱方面,高浓度的1：2：1的混合脂肪酸较有助于维持脂代谢相关基因的正常表达。第三部分外源脂肪酸对大鼠原代肝细胞功能和糖脂质代谢相关基因表达的影响目的探讨外源性脂肪酸对大鼠原代肝细胞功能和糖脂代谢相关基因表达的影响,为预防糖尿病的发生提供参考依据。方法采用改良二步胶原酶灌注法对SD大鼠的肝脏细胞进行提取分离和培养,细胞分组、脂肪酸种类、浓度和混合比例与L02细胞实验一致。利用MTT法观察细胞存活率；用分光光度法检测培养液中LDH、AST和ALT活性；实时荧光定量(qRT-PCR)技术检测葡萄糖激酶(GCK)、SREBP-1c、PPAR-γ和LXRa mRNA的表达。结果(1)在低浓度下,各组细胞存活率呈上升趋势,但当PA和OA浓度超过3.2μg/ml后,细胞存活率均呈下降趋势；而随着DHA浓度的增加,细胞存活率仍显著上升(P<0.01)。在混合脂肪酸组中,各处理亚组的细胞存活率均显著低于空白对照组(P<0.01)(2) PA、OA和DHA亚组的胞外LDH、AST和ALT水平与空白对照组比较均没有发生显著升高的现象。混合脂肪酸组中,各亚组的AST和ALT水平与空白对照组比较均没有显著升高；在3.2μg/ml下,三个亚组的LDH水平均显著高于空白对照组(P<0.05),而在12.8μg/ml时三个亚组中的LDH水平与空白对照组比较没有的显著性变化,但显著高于等剂量单独处理的DHA亚组。(3)除1：1：1亚组外,高浓度12.8μg/ml时,各亚组的GCK mRNA表达量较空白对照组和相应的低浓度组均显著升高(P<0.05)；除1：1：1亚组、12.8μg/ml下的DHA和1：1：2亚组外,其他各亚组的SREBP-1c mRNA的表达较空白对照组均显著降低(P<0.05)；与空白对照组比较,各亚组的PPAR-γ mRNA表达均显著降低(P<0.05),各亚组的LXRa mRNA表达在高浓度12.8μg/ml时均呈升高趋势。结论脂肪酸的浓度、种类以及比例对大鼠原代肝细胞中GCK mRNA表达均有较大的影响。在低浓度中,混合脂肪酸1：1：l亚组中GCK mRNA的上调最为显著;在DHA或混合脂肪酸(1：1：1和1：2：1)情况下,GCK mRNA的表达在一定程度上依赖于SREBP-1c mRNA的表达；与L02细胞一样,外源性脂肪酸的种类、剂量和比例都能够影响大鼠原代肝细胞的功能和脂代谢相关基因的表达。