肺血管重塑是肺动脉高压的主要病理变化特征，而肺动脉高压是临床上许多常见疾病的严重并发症之一，同时也是多病因、迄今发病机制仍不清楚的一种疾病。在肺动脉高压的发生过程中，与肺血管重塑相关的刺激包括血管的跨壁压、扩张、切应力、缺氧、各种介质(如血管紧张素Ⅱ、内皮素-1，生长因子，炎性细胞因子)，5-HT是其中较为重要的一种。5-HT可以通过相应受体诱发细胞内相关信号转导机制如钙离子升高，磷脂酰肌醇(PIP)、PKC、MAPK等的激活，不仅可以引起肌细胞的收缩，还能启动细胞周期，调节肺动脉平滑肌细胞(PASMC)的增殖与凋亡，引起肺血管壁增厚和肺动脉高压。 端粒酶被称为细胞寿命的生物钟，TERT则是端粒酶的催化亚基，是决定端粒酶活性的限速因子。TERT可在端粒酶活性为阴性的细胞异位表达，从而使端粒酶活性重现，使细胞寿命延长。TERT可通过影响Bcl、P53、Caspase蛋白酶家族和细胞周期素家族等活性物质在细胞增殖和凋亡中发挥重要的调节作用。 反义核酸可干扰基因产物的表达，是基因治疗的有效方法。目前，反义端粒酶基因疗法已经在肿瘤治疗方面做了大量的工作。鉴于TERT在第四军医大学硕创卜学位论文PASMC增殖中的重要意义，通过调节TERT基因表达来抑制队SMC的增殖可能是治疗慢性肺动脉高压的有效方法。 本实验预实验结果已在动物模型的整体水平上证明MCT诱导的PH时PASMC中5一HT含量明显增高，5一HT受体表达也显著增加;TERT可在大鼠肺血管平滑肌、支气管平滑肌和软骨组织中表达，并且MCT组肺组织中TERT表达较正常组呈明显阳性增强。因此，为深入研究TERT在肺血管重塑中的作用，本研究采用反义寡核营酸技术探讨TERT在5一HT诱导的PASMC增殖作用的影响及机制，具体研究如下:一、TERT对5一盯诱导的PASMC增殖的影响1.5一HT诱导大鼠以SMC增殖试验 分别加入一。一9、10一8、10一，、10一6、10一smol·L一’的5一HT后，大鼠队sMC和对照组相比，MTT试验的OD值依次升高，并具有统计学意义。这提示在10一10一smol·L一l的剂量范围内，5一 HT对大鼠队sMc的促增殖作用随5一HT浓度的升高而呈剂量依赖性增强。但10一6 mol·L一，浓度组与10一smol·L一，浓度组的oD值差别无统计学意义，提示5一HT到达10一6mol·L一’浓度后，对大鼠PAsMc的促增殖作用可能进入平台期。2.TERT在5一HT诱导的大鼠PASMC中的蛋白表达 正常对照组和5一HT组的TERT染色均为阳性主要在胞浆中表达，在胞核中也有少量分布。与对照组相比，5一HT组的 TERT表达量明显较高，这提示5一HT可能直接或间接促进TERT的表达。3.TERT在5一HT诱导的大鼠PASMC中的mRNA表达 正常对照组和5一HT组的TERT mRNA染色均为阳性。与对照组相比，5一HT组的TERT mRNA含量明显较高，这提示5一HT可能直接或间接促进TER’1，mRNA的表达。4.反义TERT寡核普酸在大鼠PASMC中的分布与作用特点 FITC标记的反义TERT寡核普酸在以sMC内呈现绿色荧光，其分布部位主要位于胞浆，胞核也有少量分布。对各时间点以SMC内不同浓 第四军医大学祠吐d二学位金仑文度反义TERT寡核普酸的摄入情况进行线像素定量分析，当作用浓度为5协mol/L时，1 Zh、24h及48h细胞内摄入FITC标记的反义TERT寡核普酸的含量均可达较高水平。表明反义丁ERT寡核普酸经硫代磷酸化修饰后，在12h内即可达到作用浓度;而72h细胞内反义TERT寡核昔酸的含量逐渐降低，但其最高荧光强度仍能达到75像素线左右，表明反义TERT寡核普酸的作用时间可持续72h以上。当作用浓度为spmol/L时，12，24，48及72h细胞内反义TERT寡核普酸的平均像素值分别为:1 89.27，189.22，218.32和157.91。由此可知，反义TERT寡核普酸在细胞中的浓度随作用时间的延长而逐渐升高，48h达到最高峰，以后则逐渐降低;浓度为2.5，5和10协mol/L作用48h，细胞内反义TERT寡核普酸的平均像素值分别为:62.36，218.犯和213.53。这表明同一时间点，不同浓度的反义TERT寡核普酸在细胞内的分布密度随作用浓度的升高而升高，但当达到一定的作用浓度后，细胞内反义TERT寡核营酸的含量随作用浓度增加升高的并不明显，其中浓度为5“moUL和浓度为10 p mol/L的反义TERT寡核着酸作用48h后，平均像素值间的差异无统计学意义(P>0.5)，表明细胞对反义TERT寡核昔酸的摄入能力是有限的。5 p mol几是反义TERT寡核若酸较为理想的作用浓度。5.反义TERT寡核普酸抑制5一HT诱导的大鼠PASMC增殖 由以上试验结果，本试验采用加入反义TERT寡核营酸5 p mol.L一，48h时间点。加入反义TERT寡核营酸后，ASODN组的0D值明显低于5一HT组，并具有统计学意义，说明反义TERT寡核昔酸可明显抑制5一HT诱导的大鼠PASMC增殖。ASODN组与对照组差别无统计学意义，说明反义TERT寡核昔酸可完全取消5一HT诱导的大鼠PASMC增殖作用。 SODN组MTT值与5一HT组差别无统计学意义，说明正义TERT寡核昔酸对5一HT诱导的大鼠PASMC增殖没有作用。6.反义TERT寡核普酸抑制PASMC TERT蛋白表达 反义核酸组与正义核酸组中TERT的表达均呈阳性。