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生物体内一定水平的自由基是维持正常生命活动所必须的,而机体氧化与抗氧化失衡则会造成氧化压力损伤,产生肿瘤、心脑血管疾病等不同的后果。斑马鱼是新型的模式动物,具有发育快速、胚胎发育早期身体透明等优点。谷胱甘肽和机体的抗氧化系统关系密切,和谷胱甘肽代谢相关的酶也会参与到抗氧化系统中。然而至今关于斑马鱼ecs、gss、gst、gpx、gsr等谷胱甘肽代谢相关酶类的表达模式、功能等方面的研究还比较少,相关的动物模型也比较缺乏。 本实验中,首先,采用 GATEWAY和 iTol2转基因技术,构建 gss:EGFP斑马鱼转基因模型,并结合原位杂交技术,确定gss的表达模式为在胚胎发育开始即1细胞时期就出现较高水平表达并在整个胚胎早期发育为全胚胎表达,24h出现晶状体、前肾导管特异性稳定表达,4日龄出现肝脏稳定表达;说明gss为胚胎发育必须基因,在肝脏、肾脏、晶状体等主要部位通过合成GSH维持机体氧化还原环境的稳定。 其次,7mM H2O2处理gss-EGFP斑马鱼模型发现基因表达有上调现象,提示gss的表达受到机体所处氧化还原环境的调控,随氧化压力的变化而变化;而荧光强度的变化,可以指示机体内氧化还原环境的变化,预计可用于药物毒性的评价及筛选、环境毒性的评价以及基因功能的进一步探究。 第三,为了得到存活率较低的基因敲除模型,用来筛选具有抗氧化活性的药物,采用 CRISPR基因敲除技术,设计 gpx1a-gRNA进行显微注射,得到gpx1a-knockout斑马鱼模型的F0代,为纯合的gpx1a-knockout斑马鱼模型构建打下了基础。