目的:首先通过网络药理学预测葛根芩连汤（GQD）调控炎症通路改善降糖效应的作用机制,得到炎症相关途径及重要靶点,预测主要抗炎活性成分与关键靶点结合能力,其次通过体内实验检测糖尿病鼠肝生化指标和肝炎症通路蛋白,最后进行抗炎活性成分体外细胞降糖作用及机制验证,探究GQD干预炎症通路改善降糖效应的作用机制。方法:1网络药理学预测GQD干预炎症通路改善降糖效应的作用机制研究（1）GQD活性成分数据库构建:通过使用TCMSP数据库和TCMIP数据库对GQD四味中药葛根、黄芩、黄连和甘草所含成分进行整理,并通过Pub Chem Compound数据库进行结构确认,去除重复化合物,下载相应化合物SDF文件,保留化合物Pub Chem CID值及Canonical SMILES相关信息,制作Excel表格构建GQD活性成分数据库。（2）GQD干预炎症通路改善降糖效应靶点数据库构建:使用在线分析软件Swiss target prediction和STITCH获得GQD活性成分有效靶点;使用Coo LGe N数据库获取炎症和T2DM靶点,再将炎症疾病靶点同T2DM靶点作交叉性分析获得共同靶点即为疾病靶点;将GQD化合物有效靶点与疾病靶点对比分析得到共有靶点,即为GQD干预炎症通路改善降糖效应的靶点。（3）GQD干预炎症通路改善降糖效应的主要活性成分分析:将GQD预测干预炎症通路改善降糖效应靶点,与GQD活性成分对应制成Excel表格,使用Cytoscape 3.2.1软件分别构建葛根活性成分-作用靶点网络、黄芩活性成分-作用靶点网络、黄连活性成分-作用靶点网络、甘草活性成分-作用靶点网络和GQD整方活性成分-作用靶点网络,分析网络中节点度值,获取方中诸药葛根、黄芩、黄连、甘草和GQD整方干预炎症通路改善降糖效应的主要活性成分。（4）GQD干预炎症通路改善降糖效应关键靶点分析:本研究使用STRING数据库获取蛋白-蛋白互作关系,联合Cytoscape3.2.1软件,根据度值分析GQD干预炎症通路改善降糖效应关键靶点。（5）GQD干预炎症通路改善降糖效应的生物过程分析:本研究采用生物学信息注释数据库DAVID,进行葛根、黄芩、黄连、甘草及GQD整方干预炎症通路改善降糖效应的主要生物过程（GO分析）分析。（6）GQD干预炎症通路改善降糖效应主要活性成分干预关键靶点的分子对接预测:通过Sybyl-X 2.0软件对GQD主要抗炎活性成分与关键靶点进行分子对接,根据预测靶点与主要活性成分的对接得分Total Score值,验证活性成分与关键靶点的结合能力。2 GQD干预炎症通路改善降糖效应的体内实验采用研究团队已建立高脂饲料联合一次小剂量链脲佐菌素(30mg·kg^-1)诱导Sprague Dawley（SD）大鼠建立糖尿病模型。随机分组:模型组、阳性组（二甲双胍）和GQD组,并以正常饮食的大鼠为对照组,给药13周后,获取各组肝脏组织冻存-80℃冰箱备用。在确认GQD体内降糖效果后,进行大鼠肝组织检测:（1）GQD对糖尿病大鼠肝脏糖脂生化指标影响:根据检测试剂盒说明书检测肝组织蛋白糖原和甘油三酯（TG）含量。（2）GQD对糖尿病大鼠肝脏抗氧化相关生化指标影响:根据检测试剂盒说明书检测肝组织丙二醛（MDA）浓度、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活力。（3）GQD对糖尿病大鼠肝脏组织炎症相关通路蛋白表达水平的影响:WB法检测炎症核转录因子-κB（NF-κBp65）、p-NF-κB（Ser536）、和下游炎症分泌因子白介素^-1β(IL^-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达,检测调控NF-κB的炎症核转录蛋白核苷酸结合寡聚化结构域样受体含pyri结构域蛋白3（NLRP3）、Toll样受体4（TLR4）、细胞因子信号转导抑制蛋白3（SOCS3）,探究GQD干预多条通路改善炎症反应的作用机制。3 GQD抗炎活性成分干预改善肝胰岛素抵抗（IR）-Hep G2细胞降糖效应机制的体外细胞实验验证考虑黄连中不少抗炎降糖成分研究较为透彻,没选定在本文中探讨。采用本课题组已建立肝IR-Hep G2细胞模型(10-9mol·L^-1胰岛素和3.75*10-6mol·L^-1地塞米松联合诱导48h),随机分组:正常组、IR模型组、阳性组（二甲双胍）和不同剂量汉黄芩苷组、梓醇组、槲皮素组,检测以下指标:（1）汉黄芩苷干预肝IR-Hep G2细胞的降糖药效及细胞活力测定（2）汉黄芩苷干预肝IR-Hep G2细胞炎症相关通路蛋白表达（3）汉黄芩苷干预肝IR-HepG2细胞胰岛素通路蛋白表达（4）梓醇干预肝IR-Hep G2细胞的降糖药效及细胞活力测定（5）梓醇干预肝IR-Hep G2细胞降糖效应相关蛋白表达（6）槲皮素干预肝IR-Hep G2细胞的降糖药效结果:1网络药理学预测GQD干预炎症通路改善降糖效应的作用机制（1）根据TCMSP数据库和TCMIP数据库分析结果,葛根含有35个化学成分、黄芩含有153个成分、黄连含有38个成分和甘草含有147个成分。葛根、黄芩、甘草共有成分穿贝海绵甾醇;葛根与黄芩共有成分β-谷甾醇、穿贝海绵甾醇、胡萝卜苷;葛根与甘草共有成分芒柄花黄素、芒柄花苷、穿贝海绵甾醇;黄芩与黄连共有成分表小檗碱、小檗碱、药根碱、对羟基肉桂酸;黄芩与甘草共有成分谷甾醇、穿贝海绵甾醇;黄连与甘草共有成分槲皮素。（2）葛根13个活性成分、黄芩37个活性成分、黄连10个活性成分、甘草42个活性成分含有有效靶点。采用数据库中炎症基因5975个,T2DM基因1402个,将2种疾病基因作交叉性分析,共获得1197个共同基因。GQD活性成分有效靶点与疾病靶点的交叉靶点85个。（3）葛根主要抗炎活性成分:葛根素、染料木素和大豆苷元;黄芩主要抗炎活性成分芹黄素、黄芩苷、汉黄芩苷和黄芩素;黄连主要抗炎活性成分槲皮素和小檗碱;甘草主要抗炎活性成分槲皮素和山柰酚;GQD整方主要抗炎活性成分:槲皮素、葛根素、小檗碱、山柰酚、芹黄素和穿贝海绵甾醇。（4）葛根干预炎症通路改善降糖效应相关靶点:CASP3、EGFR、ESR1、PPARG、TLR4;黄芩干预炎症通路改善降糖效应关键靶点:IL6、TNF、AKT1、PTGS2、VEGFA;黄连干预炎症通路改善降糖效应关键靶点:AKT1、TP53、EGFR;甘草干预炎症通路改善降糖效应关键靶点:AKT1、TNF、EGFR;GQD干预炎症通路改善降糖效应关键靶点:IL6、AKT1、TNF和VEGFA。（5）黄芩生物学通路531条,主要影响炎症反应、脂质分解代谢过程、NF-κB转录因子调控等;黄连生物学通路238条,主要影响胰岛素受体信号通路、胰岛素样生长因子受体信号通路、增殖凋亡和转录调节等;甘草生物学通路225条,主要影响胰岛素受体信号通路、胰岛素刺激反应、MAPK活性调控等。通路富集分析结果显示GQD生物学通路748条,主要影响脂质分解代谢过程、调控IL6产生、炎症反应等。（6）AKT1与GQD抗炎活性成分汉黄芩苷、梓醇、槲皮素、葛根素、黄芩苷和山柰酚具有较好的结合活性;IL6与槲皮素、黄芩苷和川贝海绵甾醇有结合活性;TNFA与汉黄芩苷、黄芩苷和川贝海绵甾醇有较好的结合活性;NF-κB与槲皮素、葛根素、黄芩苷、川贝海绵甾醇有较好的结合活性,与汉黄芩苷和梓醇有结合活性;NLRP3与槲皮素、葛根素、黄芩苷、梓醇有较好的结合活性;TLR4与槲皮素和芹黄素有结合活性;SOCS3与大豆苷元有较好的结合活性,与槲皮素和黄芩苷有结合活性。2 GQD干预T2DM大鼠的炎症相关通路研究（1）与正常组相比,糖尿病模型组大鼠肝糖原水平极显著下降（P<0.001）;与模型组相比,GQD组与二甲双胍组糖原水平极显著上升（P<0.001）。与正常组相比,糖尿病模型组TG水平极显著上升（P<0.001）;与糖尿病模型组相比,GQD组与二甲双胍组TG水平显著下降（P<0.05,P<0.01）。（2）与正常组相比,糖尿病模型组大鼠肝MDA含量极显著上升（P<0.001）;与模型组相比,GQD组与二甲双胍组MDA水平显著下降（P<0.01,P<0.05）。与正常组相比,糖尿病组大鼠SOD水平有下降趋势;与模型组相比,GQD组与二甲双胍组SOD水平有上升趋势,但均未达到统计学意义。与正常组相比,糖尿病组大鼠CAT活力极显著下降（P<0.001）;与模型组相比,GQD组CAT活力有上调趋势,二甲双胍组CAT活力显著增强（P<0.05）。（3）与正常组相比,糖尿病模型组大鼠NLRP3蛋白表达水平极显著上升（P<0.001）;与糖尿病组相比,GQD组和阳性组表达水平显著下降（P<0.001,P<0.01）。与正常组相比,糖尿病组TLR4蛋白表达水平极显著上升（P<0.001）;与糖尿病组相比,GQD组和阳性组表达水平极显著下降（P<0.001）。与正常组相比,糖尿病组SOCS3蛋白表达水平上升;与糖尿病组相比,GQD组和阳性组表达水平显著下降（P<0.001,P<0.05）。与正常组相比,糖尿病组IL^-1β和IL-6蛋白表达水平显著上升（P<0.01,P<0.05）;与糖尿病组相比,GQD组IL^-1β和IL-6蛋白水平显著下降（P<0.01）。与正常组相比,糖尿病组TNF-α蛋白表达水平上升;与糖尿病组相比,GQD组和阳性组表达水平显著下降（P<0.01,P<0.05）。与正常组相比,糖尿病模型组p-NF-κB（Ser536）/NF-κB（p65）蛋白表达水平显著上升（P<0.05）;与糖尿病组相比,GQD组和阳性组表达水平显著下降（P<0.001,P<0.01）。3 GQD抗炎活性成分改善肝IR-Hep G2细胞的降糖效应研究（1）汉黄芩苷实验:与正常组相比,IR模型组葡萄糖消耗量均显著下降（P<0.001）;与IR组相比,汉黄芩苷干预36h,IR细胞摄糖量增加,48h差异最明显,20、50μmol·L^-1汉黄芩苷明显增加IR-Hep G2细胞葡萄糖消耗量（P<0.001）。各浓度汉黄芩苷组对Hep G2细胞活力无明显影响。（2）汉黄芩苷干预肝IR-Hep G2细胞48h,WB检测炎症通路转录因子NLRP3、SOCS3、TLR4和NF-κB（p65）及下游炎症效应因子IL^-1β、IL-6和TNF-α蛋白表达水平。结果显示:与正常组相比,IR模型组NLRP3、SOCS3、TLR4、NF-κB（p65）、IL^-1β、IL-6和TNF-α蛋白水平均显著上升（P<0.001）;与IR组相比,汉黄芩苷组(1、5、10、20、50μmol·L^-1)显著下降炎症通路NLRP3、SOCS3、TLR4、NF-κB、IL^-1β、IL-6和TNF-α蛋白表达量（P<0.001）。（3）汉黄芩苷干预IR-Hep G2细胞48h,WB检测胰岛素通路相关蛋白表达水平。结果显示:与正常组相比,IR模型组p-PI3K（Thr607）/PI3K（p85）蛋白水平明显下调（P<0.001）;与IR组相比,汉黄芩苷组(5、10、20、50μmol·L^-1)升高p-PI3K（Thr607）/PI3K（p85）蛋白表达（P<0.001、P<0.05、P<0.01、P<0.01）,1μmol·L^-1组影响不明显。与正常组相比,IR模型组p-Akt（Ser473）/Akt蛋白水平明显下调（P<0.001）;与IR组相比,汉黄芩苷组(1、5、10、20、50μmol·L^-1)浓度均明显升高p-Akt（Ser473）/Akt蛋白表达（P<0.001、P<0.001、P<0.05、P<0.001、P<0.001）,各组Akt表达差异不大。与正常组相比,IR模型组GLUT1和GLUT4蛋白水平明显下调（P<0.001）;与IR组相比,汉黄芩苷组(1、5、10、20、50μmol·L^-1)明显升高GLUT1和GLUT4蛋白表达（P<0.001）。与正常组相比,IR模型组GLUT2蛋白水平上调;与IR组相比,除浓度1μmol·L^-1组外,5、10、20μmol·L^-1汉黄芩苷组极显著上调GLUT2的蛋白水平（P<0.001）。（4）梓醇实验:与正常组相比,IR模型组葡萄糖消耗量均显著下降（P<0.001）,与IR模型组相比,梓醇给药18h,5、10μmol·L^-1增加IR-Hep G2细胞葡萄糖消耗量（P<0.05,P<0.01）;给药24h,梓醇组(2.5、5、10μmol·L^-1)增加IR-Hep G2细胞葡萄糖消耗量（P<0.05,P<0.05,P<0.01）;给药48h差异最明显,2.5、5、10μmol·L^-1梓醇明显增加IR-Hep G2细胞摄糖量（P<0.001）。各剂量给药组对细胞活力没有明显影响。（5）与IR模型组相比,梓醇组(2.5、5、10μmol·L^-1)组PPARα蛋白表达量升高（P<0.05、P<0.001、P<0.01）;10μmol·L^-1梓醇升高PPARδ表达（P<0.001）。与正常组相比,IR模型组p-Akt（Ser473）/Akt蛋白水平表达显著下降（P<0.05）;与IR组相比,梓醇组(2.5、5、10μmol·L^-1)上调p-Akt（Ser473）/Akt（P<0.05、P<0.001、P<0.001）;与正常组相比,IR模型组FABP4蛋白水平表达显著上升（P<0.001）;与IR组相比,梓醇组(5、10μmol·L^-1)下调FABP4表达（P<0.05、P<0.01）。（6）与正常组相比,IR模型组葡萄糖消耗量显著下降（P<0.001）;与IR组相比,槲皮素(5、10、20μmol·L^-1)干预24h明显增加IR-Hep G2细胞摄糖量（P<0.01）。结论:本研究通过信息化层面初步预测复方GQD干预炎症相关通路改善降糖效应的潜在活性成分,与GQD配伍的四味中药中发挥抗炎作用成分密切相关。GQD干预炎症相关通路重要靶点与黄芩发挥抗炎作用的重要靶点相类似,因此推测作为清热抗炎中药黄芩在复方GQD抗炎降糖效应中起到重要作用,且预测黄芩干预炎症通路改善降糖效应的生物过程包含炎症反应、NF-κB转录因子调控、胰岛素刺激反应和氧化还原等。采用计算机辅助虚拟分子对接验证活性成分与重要靶点结合活性,进一步预测GQD干预炎症通路改善降糖效应的作用成分。本文体内实验研究表明GQD调控肝NLRP3和SOCS3抑制TLR4/NF-κB等炎症信号通路,改善肝糖脂水平及提高抗氧化能力。结合本实验室之前确定GQD体内激活肝PPARs改善IR,推测GQD多通路多靶点抑制NF-κB调控的炎症信号通路,调节糖脂稳态,改善胰岛素敏感性,增强降糖效应。体外实验验证来自黄芩的黄酮类成分汉黄芩苷干预NLRP3/SOCS3调控TLR4/NF-κB炎症信号通路。黄芩中环烯醚萜类成分梓醇激活PPARs通路,可能通过抑制NF-κB信号通路来调控糖脂稳态。GQD抗炎活性成分黄酮类成分槲皮素显示具有较好的降糖效果。综上,复方GQD多个成分存在单靶点叠加、多靶点协同作用干预炎症相关通路改善降糖效应。