论文部分内容阅读
目的:基于肠道真菌群及其代谢产物b-葡聚糖介导的Dectin-1/IL-1b信号通路探讨丹皮酚抗酒精性肝病(alcohol liver disease,ALD)炎症损伤的作用机制。方法:本研究将90只C57BL/6雄性小鼠随机分为正常组、ALD模型组、阳性药物组、丹皮酚高、中、低剂量组,采用Lieber-De Carli酒精液体饲料自由饮食的方法建立酒精性肝病小鼠模型。通过血清生化检测TG、TC、ALT、AST、γ-GT,肝脏HE染色、油红O染色验证模型成功。通过ITS高通量测序检测小鼠肠道真菌群,分析肠道真菌种属的变化。通过HE染色观察回肠病理变化,并通过免疫组化、Western blotting、qRT-PCR检测回肠ZO-1、Claudin-1蛋白与基因表达。通过ELISA检测血清b-葡聚糖、caspase-1、IL-1b以及肝组织匀浆NLRP3水平,免疫组化检测肝脏caspase-1、NLRP3蛋白表达,免疫荧光检测肝脏巨噬细胞F4/80、IL-1b表达,Western blotting、qRT-PCR检测肝脏Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1、pro-IL-1b、IL-1b蛋白与基因表达。另外我们还建立体外b-葡聚糖诱导巨噬细胞炎症模型进一步验证丹皮酚抗ALD炎症损伤的作用机制。MTT检测细胞活性,倒置显微镜观察细胞形态学变化,流式细胞术检测巨噬细胞表面标记物F4/80的表达,免疫荧光检测巨噬细胞内NLRP3表达,Western blotting、qRT-PCR检测巨噬细胞Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1蛋白与基因表达,ELISA检测细胞上清IL-1b、IL-18水平。结果:HE染色与油红O染色发现ALD模型组肝脏有大量脂肪滴出现,酒精喂养后血清TG、TC、ALT、AST、γ-GT较正常组显著升高。丹皮酚干预后肝脏脂肪滴减少,血清TG、TC、ALT、AST、γ-GT较ALD模型组显著降低。ITS测序结果表明ALD模型组肠道真菌种类和丰度较正常组明显升高,丹皮酚干预后肠道真菌种类和丰度较ALD模型组组明显减少,尤其在酿酒酵母目(Saccharomycetales)、德巴酵母科(Debaryomycetaceae)、白色念珠菌属(Candida)、真菌种(fungi＿sp)水平上。回肠HE染色发现ALD模型组肠粘膜受损严重,丹皮酚干预后受损肠粘膜得到改善。免疫组化、Western blotting、qRTPCR结果表明ALD模型组回肠ZO-1、Claudin-1蛋白与基因表达较正常组明显降低,丹皮酚干预后较ALD模型组则明显升高。ELISA结果表明ALD模型组血清中b-葡聚糖、caspase-1、IL-1b以及肝组织匀浆中NLRP3水平较正常组明显升高,而丹皮酚干预后较ALD模型组明显减少。免疫组化结果表明ALD模型组肝脏caspase-1、NLRP3蛋白表达较正常组明显增多,丹皮酚干预后较ALD模型组明显减少。免疫荧光结果表明ALD模型组肝脏巨噬细胞F4/80、IL-1b表达较正常组明显增多,丹皮酚干预后肝脏巨噬细胞F4/80、IL-1b表达较ALD模型组明显减少。Western blotting与qRT-PCR结果表明ALD模型组肝脏Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1、pro-IL-1b、IL-1b表达较正常组均显著增多,丹皮酚干预后均较ALD模型组显著降低。体外细胞实验中,MTT结果表明b-葡聚糖诱导组较空白组细胞活性显著降低,丹皮酚干预组细胞活性较b-葡聚糖诱导组显著升高。形态学结果发现b-葡聚糖诱导组巨噬细胞较空白组出现明显分化现象,丹皮酚干预组细胞分化较少。流式细胞与免疫荧光结果表明b-葡聚糖诱导组巨噬细胞F4/80与NLRP3表达较空白组明显增多,丹皮酚干预后均明显减少。Western blotting与qRT-PCR结果表明b-葡聚糖诱导组巨噬细胞Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1表达较空白组均显著增多,丹皮酚干预后均显著降低。ELISA结果表明b-葡聚糖诱导组IL-1b与IL-18水平较空白组明显升高,丹皮酚干预后均显著降低。结论:体内实验表明丹皮酚可以通过减少肠道白色念珠菌的丰度,从而抑制了b-葡聚糖介导的Dectin-1/IL-1b炎症信号通路,并最终发挥抗酒精性肝病炎症损伤的作用。体外实验则进一步验证丹皮酚通过调节肠道真菌菌群相关的Dectin-1/IL-1b信号通路关键蛋白,而发挥抗酒精性肝病炎症损伤的作用。