链霉菌BM10菌株产抗植物疫霉菌抗生素的分离、纯化和结构鉴定

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链霉菌(Streptomyces)BM10菌株是由本实验室于2005年从海南霸王岭原始森林土壤中分离筛选得到的一株生防菌,前期研究结果表明,BM10菌株发酵液无菌滤液对香蕉枯萎病菌1、4号小种(F.oxysporumLsp.cubenseracel、race4)、黄瓜枯萎病菌(F。oxysporumf.spcucumerinum)、西瓜枯萎病菌(F.oxysporumf.sp.niveum)、辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)、香蕉炭疽病菌[Colletotrichummusae(Berk.etCurt.)Arx]等多种重要植物病原真菌具有强烈抑制作用,BM10菌株发酵液在自然光照8h、紫外线辐射2h、100℃加热1h、pH2至pH12处理24h和贮存6个月等条件下抑菌活性保持稳定,具有开发成农用抗生素的前景。本研究对链霉菌BM10菌株进行了形态特征、培养性状和生理生化性状的鉴定,对其产生的抗生素进行了分离、纯化、结构鉴定和对辣椒疫病防治效果进行了田间小区试验,其主要研究结果如下: 1.根据菌丝形态、孢子形状、在不同培养基上的培养特征及明胶液化、淀粉水解、纤维素上生长情况、H2S的产生、碳源利用一系列生理生化特征,按照《放线菌的分离和鉴定》(阎逊初,1992),结合BM10菌株16SrDNA序列分析结果,将链霉菌BM10菌株初步鉴定为链霉菌烬灰类群白浅灰链霉菌的一个新菌株。 2。建立了从BM10菌株发酵液中分离纯化抗生素的技术方法。将预处理后的发酵液,于45℃进行浓缩,经乙酸乙酯萃取三次,合并浓缩获得链霉菌BM10菌株活性物质的粗提。以辣椒疫霉为活性追踪测试菌,通过减压柱层析、氯仿-甲醇梯度洗脱、硅胶柱层析、结晶和重结晶,获得了单组份活性化合物SR-1。其技术流程为:活性粗提物质(17.3g)-甲醇溶解,(60~80目)硅胶拌样-减压柱层析,以氯仿-甲醇梯度洗脱(比例为1:0、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、0:1,V/V)-活性部分-硅胶柱层析-结晶,重结晶-单一活性化合物SR-1,TLC展开系统为氯仿:甲醇:水(8:2:0.2,V/V),高锰酸钾显色为淡黄色,Rf值为0.425,HPLC检测纯度达97%。 3。通过理化性质和UV、1H-NMR、13C-NMR等色谱分析,明确了SR-1是一个核苷类化合物,分子量:291,分子式:C12H13N5O4,与已知化合物丰加霉素(Toyocamycin)结构一致。 4.根据SR-1的化学结构分析,经文献查询和多项实验,建立了链霉菌BM10发酵液中代谢产物SR-1含量检测方法,流动相:甲醇/水(V/V,1:4),流量:0.6mL/min;柱温:室温;检测波长:230nm,277nm;进样体积:10μL;tR=13.48min。求得回归方程:Y=706.33X+0.0323,变异系数r=0.9999,线性范围为:1.56μ/mL~12.5μg/mL,平均回收率为99.34%,相对标准偏差RSD为0.71%,不同容积的摇瓶中(1L、2L、5L)链霉菌BM10发酵液中代谢产物SR-1的含量分别为53.89μg/mL,28.23μg/mL,23.76μg/mL。 5.首次明确了丰加霉素对辣椒疫霉菌具有强抑菌活性,0.01mg/mLSR-1的抑菌效果达100%。田间小区试验结果表明,链霉菌BM10菌株发酵上清液浓缩10倍液的防治效果达89.96%,显著高于72%甲霜灵锰锌600倍的防治效果64.35%。
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