获得或构建可准确调控的植物基因启动子而实现对目的基因表达的精确调控，使目的基因定时、定量和定位的表达，是转基因植物中控制目的基因表达的主要和有效手段。目前研究最多的是利用外源诱导物诱导启动基因转录，但这种诱导方式存在物种局限性、药物残留和成本高等多种缺陷。热激启动子是受温度诱导时启动基因转录，与其他诱导型启动子相比，它克服了利用外源诱导物对植物及环境等方面所带来的不良影响，便于对目的基因进行经济、有效和精确地调控，因此倍受人们的关注，但迄今为止克隆的热激启动子几乎都存在表达遗漏问题，给热激启动子的实际应用带来了困难。本研究克隆了拟南芥热激基因启动子AtHSP70b，详细分析了它在转基因烟草中的热激表：特性，并对其序列进行了改造，获得了的严谨性和灵敏性表达的人工热激基因启动子HSP70m，为今后对一些目的基因进行精确的热激调控奠定了基础。主要结果如下： 1.拟南芥热激启动子AtHSP70b的克隆根据拟南芥热激启动子AtHSP70b基因序列设计两个特异性引物Prim1(TATATCCCGGTCGGTGAATC)和Prim2(GGAAGTGAGGTTTTTCGATTTC)，采用高保真的pfuDNA聚合酶，从拟南芥(Arabidopsisthaliana)Columbia生态型植株基因组DNA中，通过PCR扩增出目标片段。纯化后的目标片段经TaqDNA聚合酶加A碱基后，采用TACloning的方法克隆到pMD18-T载体中，得到重组质粒pMD-AtHSP70b，转化大肠杆菌XL1-Blue，挑取白色的重组子单菌落进行PCR筛选和质粒的酶切验证。委托上海生工生物工程有限公司对阳性克隆测序。结果表明，PCR扩增的目标片段为204bp，与已发表的拟南芥热激启动子AtHSP70b的序列一致。 2.人工热激启动子HSP70m的设计、合成及序列测定将拟南芥热激启动子AtHSP70b序列中的不完善热激元件改造成完善的热激元件(nnGAAnnTTCnnGAAnn)并剔除其他已知的潜在顺式元件，设计出人工热激启动子HSP70m的调控区域，委托上海生工生物工程有限公司合成该片段的序列。将人工合成的HSP70m的调控区域与从pSAU2006中PCR扩增得到的-46mini35S：GUS片段连接后，通过TACloning方法克隆到pMD18-T载体中，得到重组质粒pM-HSP70mGUS5，转化大肠杆菌XL1-Blue，挑取白色的单菌落进行PCR筛选，将检验得到的阳性重组子单菌落送上海生工测序。序列结果与预期设计的序列一致，表明已构建成人工热激启动子HSP70m。 3.植物表达载体的构建质粒pMD-AtHSP70b和pM-HSP70mGUS5分别经EcoRⅠ+XbaⅠ双酶切后回收含有AtHSP70b和HSP70m启动子的大片段，分别与从质粒pSAU2006经EcoRⅠ+XbaⅠ酶切后回收的GUS-Tnos片段相连接，得到了分别含有AtHSP70b-GUS-Tnos和HSP70m-GUS-Tnos基因表达盒的中间载体pM-HSP70bGUS和pM-HSP70mGUS。该中间载体再经EcoRⅠ+HindⅢ双酶切后回收AtHSP70b-GUS-Tnos和HSP70m-GUS-Tnos基因表达盒片段，分别与pVCT2020的EcoRⅠ+HindⅢ酶切大片段连接，得到双元植物表达载体pV-HSP70bGUS和pV-HSP70mGUS。 4.AtHSP70b-GUS和HSP70m-GUS基因导入烟草基因组以无菌烟草叶片为材料，用农杆菌LBA4004/pV-HSP70bGUS和LBA4004/pV-HSP70mGUS作菌株，经过共培养、抑菌培养和150m/L的Kan抗性筛选后得到烟草的抗性愈伤组织和抗性芽。将抗性芽转到MS+0.2mg/LNAA+糖30g/L+琼脂7.0g/L+300mg/LCb+150mg/LKan的抗性生根培养基中，获得具有Kan抗性的烟草转基因植株。待烟草再生苗长至5片叶左右时将移栽到营养钵中。取转基因烟草的叶片用CTAB法提取其基因组DNA，以热激启动子AtHSP70b和人工热激启动子HSP70m上游端的引物Prim1及GUS中间部位的引物Prim6为引物对进行PCR扩增。结果表明，转AtHSP70b-GUS基因的植株基因组DNA能扩增出673bp的目标条带，与质粒阳性对照相一致。转HSP70m-GUS基因的植株基因组DNA能扩增出586bp的目标条带，与质粒阳性对照相吻合。表明目的基因AtHSP70b-GUS和HSP70m-GUS已分别整合进到烟草基因组中。 5.热激启动子AtHSP70b和人工热激启动子HSP70m在烟草中的热激诱导表达特性分析两种转基因的烟草植株的叶圆片在不同温度下处理，经过GUS组织化学染色后发现：在转AtHSP70b-GUS基因的烟草中GUS基因的表达活性随着温度的升高而增强，表明热激启动子AtHSP70b的活性随温度的升高表达活性增强，但没有明显的温度诱导界限。AtHSP70b-GUS基因在常温下和4℃低温下也有不同程度的表达，表明AtHSP70b热激诱导表达不严谨，存在非高温下的表达遗漏。在转HSP70m-GUS基因的烟草中，人工热激启动子HSP70m只在29℃～38℃范围内才会表达，此温度范围内启动子HSP70m的表达活性随温度的升高而增强，而低于29℃或高于38℃时均不表达，表明该人工热激启动子具有受高温严紧性诱导的表达特性，达到了对热激启动子AtHSP70b改造的预期目的。 6.植物表达载体pV-HSP70mGUS对番茄的遗传转化将在番茄分化培养基上预培养2天的番茄子叶和茎段投入到活化的农杆菌LBA4404(pV-HSP70mGUSinLBA4404)菌液中浸染8～10分钟。经共培养、抑菌培养和50mg/L的Kan抗性筛选后获得了番茄的抗性愈伤组织。每两周更换一次培养基直至分化出抗性不定芽，从每块愈伤组织上取一个不定芽将其转入生根培养基上诱导生根，从而获得了具有Kan抗性的番茄转基因再生苗。