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研究目的:研究他克莫司(即FK506)及5-Fu对体外培养肝癌细胞株增殖及血管内皮细胞生长因子表达的影响,从而明确普乐可复对体内除淋巴细胞外的细胞,如肿瘤细胞的多种信号传导机制是否存在影响。以期是否可以对肝癌患者肝移植术后,在抗排斥药物及抗肿瘤药物的作用下,体内残存肿瘤细胞的生物学活性进行判断,进而初步推测是否可以通过早期抑制残存肿瘤细胞血管内皮细胞生长因子的表达,减少移植术后肝癌复发转移率,改善肝癌患者移植术后远期预后。研究方法:在体外细胞培养条件下,通过MTT方法检测FK506及5-Fu对肝癌细胞株SMMC-7721增殖的影响,ELISA方法检测肝癌细胞株培养液上清VEGF的水平变化,半定量RT -PCR检测各组肝癌细胞株VEGF的mRNA表达情况变化,Western blotting免疫印迹法检测肝癌细胞株VEGF蛋白的表达水平变化及VEGF蛋白的定量分析。并通过对肝癌裸鼠种植瘤质量、体积以及小鼠血浆VEGF水平的分析,辅以种植瘤组织病理切片中VEGF表达和微血管密度分析,研究普乐可复及氟尿嘧啶对肝癌细胞株SMMC-7721种植瘤增殖及血管内皮细胞生长因子表达的影响。结果:1、MTT法测定肝癌细胞增殖情况:与无药物对照组相比,FK506组、5-Fu组及FK506 + 5-Fu组对培养72小时肝癌细胞均有不同程度的增殖抑制现象,FK506 + 5-Fu组增殖抑制现象较前三组明显。对照组A450值为0.728士0.07,FK506组A450值为0.570士0.38,5-Fu组A450值为0.386士0.21,FK506 + 5-Fu组A450值为0.242士0.47。P<0.05表示差异有统计学意义。2、ELISA方法检测肝癌细胞株培养液上清VEGF的水平:与无药物对照组相比,FK506组、5-Fu组及FK506 + 5-Fu组对培养24小时肝癌细胞上清液中血管内皮细胞生长因子的水平均有不同程度降低,FK506 + 5-Fu降低程度较明显。对照组VEGF浓度值为194.3pg/ml±5.53pg/ml,FK506组VEGF浓度值为165.7pg/ml±6.32pg/ml,5-Fu组VEGF浓度值为144.3pg/ml±3.62pg/ml,FK506 + 5-Fu组VEGF浓度值为132.3pg/ml±4.56pg/ml。P<0.05表示差异有统计学意义。3、RT -PCR检测肝癌细胞株VEGF的mRNA表达情况:各组中肝癌细胞株VEGF-mRNA的表达以无药对照组最多,较无药对照组FK506组、5-Fu组、FK506 + 5-Fu组较少。各组检测物OD值与β-actin OD值的比值:对照组比值为1.60士0.187,FK506组比值为1.00士0.20,5-Fu组比值为0.58士0.08,FK506 + 5-Fu组比值为0.38士0.08。P<0.05表示差异有统计学意义。4、免疫印迹法检测肝癌细胞株VEGF蛋白的表达水平:各组中肝癌细胞VEGF蛋白的表达以无药对照组最多,FK506组、5-Fu组、FK506 + 5-Fu组较少。各种检测物OD值与β-actin OD值的比值:对照组比值为1.38士0.084,FK506组比值为0.98士0.130,5-Fu组比值为0.60士0.087,FK506 + 5-Fu组比值为0.36士0.089。P<0.05表示差异有统计学意义。5、肝癌细胞株VEGF蛋白表达定量分析:对照组VEGF蛋白表达值为840.7pg/ml±54.36pg/ml,FK506组VEGF表达值为630.5pg/ml±36.84pg/ml,5-Fu组VEGF表达值为510.5pg/ml±29.10pg/ml,FK506 + 5-Fu组VEGF表达值为341.5pg/ml±38.14pg/ml。P<0.05表示差异有统计学意义。6、FK506及5-Fu对肝癌裸鼠移植瘤生长的影响:FK506对种植瘤生长无明显抑制作用。5-Fu对种植瘤生长有明显的抑制作用,FK506与5-Fu无明显的协同作用。FK506对瘤组织VEGF表达无明显抑制作用,5-Fu对VEGF表达存在明显的抑制作用,FK506与5-Fu无明显的协同作用。FK506对瘤组织微血管形成无明显抑制作用,5-Fu对瘤组织微血管形成存在明显的抑制作用,FK506与5-Fu无明显的协同作用。电泳产物分析:与无药物对照组相比,FK506组、5-Fu组及FK506 + 5-Fu组对培养的肝癌细胞株及血管内皮细胞生长因子的mRNA及蛋白表达均有不同程度的增殖抑制现象,FK506 + 5-Fu组增殖抑制现象明显。结论:普乐可复(5ug/L)对体外培养的肝癌细胞株SMMC 7721的增殖及血管内皮生长因子表达均有抑制作用,氟尿嘧啶(75mg/L)对普乐可复(5ug/L)预处理的肝癌细胞株SMMC 7721在增殖及血管内皮生长因子表达也均有抑制作用。FK-506与5-FU对体外培养肝癌细胞生长及血管内皮细胞生长因子的抑制作用,可能存在协同效应。但普乐可复对肝癌裸鼠种植瘤的生长、VEGF表达及瘤组织中微血管的生成无明显抑制作用,5-Fu此方面作用明显。