背景与目的肿瘤的生长依赖于血管的新生,抑制肿瘤血管生成已经成为肿瘤治疗的一种策略。VEGF通过与血管内皮细胞膜的VEGF受体(VEGFR)结合,触发信号转导,转导级联反应,引起血管内皮细胞有丝分裂,刺激内皮细胞增殖和血管生成。VEGF/VEGFR通路可特异性促进内皮细胞增殖、参与血管形成、增加血管通透性及保护受损神经元等,不仅在胚胎发育、伤口愈合、炎症、肿瘤等多种生理及病理过程中发挥重要作用,而且参与缺血性脑血管病的损伤及抗损伤过程。VEGF具有增加微血管通透性、促进不同来源的内皮细胞分裂增殖和血管构建、促使内皮细胞迁移等多种作用。大多数肿瘤细胞高水平地表达VEGF,且其表达与肿瘤的恶性程度呈正相关,因此,VEGF及其受体成为目前抗肿瘤血管形成治疗最为成熟的靶分子。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指由双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)引发的转录后基因沉默机制,能够高效特异地沉默同源基因的表达,是一种转录后调控。RNAi技术不仅在功能基因组研究中发挥了重要的作用,而且是一种潜在的以特异性基因沉默为方法治疗疾病的手段。尤其在肿瘤的干预中更具有潜在意义。目前,通过RNAi技术干涉VEGF的表达能够抑制胰腺癌、喉鳞癌、大肠癌和肺癌等细胞株的增殖、生长、侵袭和迁移。本课题,我们利用RNAi干涉技术,沉默肺癌细胞中VEGF的表达,从而达到干预肺癌生长增殖的目的,为肺癌的基因治疗提供新的理论依据。期望能够获得一个持续高效的抑制肺癌细胞中VEGF表达的RNAi片段,从体外、内观察其对肺癌细胞增殖和肺内癌肿生长的影响,并探讨其干预机制。材料和方法通过筛选获得理想的能够沉默肺癌细胞中VEGF表达的shRNA片段,并将其插入到载体中,制备成pSilencer-VEGF-shRNA;体外利用该质粒对肺癌A549细胞系进行干预后,动态观察A549细胞中VEGF的表达、肺癌细胞的生长及内皮细胞小管结构的形成;用A549和pSilencer-VEGF-A549细胞分别接种裸鼠,观察荷瘤裸鼠体内肿瘤组织的生长及生存期。使用RT-PCR和免疫印迹的方法检测与内皮细胞相互作用后干涉VEGF的A549细胞内p53、Bcl-2和Bax转录和蛋白水平上的变化。研究结果经RT-PCR和免疫印迹实验检测发现pSilencer-VEGF-2对肺癌细胞中VEGF的抑制率能够达到90%以上;在稳定转染的肺癌细胞株A549细胞中,2个月以后对VEGF的抑制率仍在80%以上;肺癌细胞生长干预实验结果显示,pSilencer-VEGF-2明显抑制了肺癌A549细胞系中VEGF的表达;虽然稳定转染pSilencer-VEGF-2的肺癌A549细胞株体外生长未发生明显变化,但是,它可以显著抑制内皮细胞的血管生成作用。体内荷瘤裸鼠实验结果显示:与接种对照组荷肺癌A549细胞株瘤的裸鼠相比,pSilencer-VEGF-2-A549荷瘤裸鼠体内肿瘤组织的生长显著减慢(P<0.05),生存期明显延长(P<0.05)。pSilencer-VEGF-2干预肺癌增殖生长的机制研究显示,稳定转染的人肺癌A549细胞株中P53,Bcl-2和Bax的表达无明显改变,也未见到明显的细胞凋亡现象。与对照组相比,在人HUVEC细胞系的作用下,稳定转染的人A549细胞中Bax表达无变化,但P53的表达明显增高,Bcl-2的表达下调,且有细胞凋亡现象。结论我们筛选构建了理想的、能够有效抑制肺癌VEGF表达的shRNA质粒pSilencer-VEGF-2;该质粒在体外和体内均能够明显抑制肺癌的发展。其机制可能是通过shRNA沉默肺癌细胞VEGF的表达,抑制了血管内皮细胞的VEGF/VEGFR通路,从而引起肺癌细胞凋亡而实现的。