研究背景创伤是人类死亡的主要原因之一,随着交通等所致的各种意外和灾害发生而呈上升的趋势。创伤性颅脑损伤(TBI)作创伤中的一种,是神经外科最常见的急症之一,创伤后会造成严重的病理后果,特别是弥漫性脑损伤的致残率及死亡率较高。虽然创伤性颅脑损伤的总体死亡率由30年前的50%降至目前的30%左右,但是存活的患者中,轻度患者10%会遗留永久残疾,而中度和重度患者可达到66%和100%。近10年来,我国有条件的神经科开始重视创伤性颅脑损伤的基础研究和临床防治应用研究,但是如何使脑创伤患者得到妥善的治疗,使其造成的后果减少到最低的程度,损伤后的神经系统得到修复,一直是神经医学工作者面临的严峻挑战。研究表明,脑创伤对神经细胞的损害不仅发生在损伤的瞬间,而且在损伤后数天内继发损害更加严重,可引起一系列继发的神经细胞生化反应。它会加重致残程度和增加死亡率。目前我们已经认识到,脑损伤后将发生一系列细胞、分子事件,这一系列事件综合作用的结果将导致神经细胞死亡,进而造成颅脑结构和功能损伤。因此,研究脑创伤后继发性神经细胞死亡的发生机理,无疑对脑创伤后神经细胞功能的恢复有重要的意义,可为脑创伤后神经保护剂的应用提供理论依据对脑创伤的救治提供新的治疗前景。脑损伤后继发性脑损伤的主要机制包括：机械损伤导致的局部组织细胞缺氧、兴奋性氨基酸毒性作用、自由基损伤、神经细胞内Ca2+超载等,受累的神经细胞包括正常神经细胞和原发性损伤后变性的神经细胞。颅脑损伤后能够诱发机体产生的内源性损伤因子主要包括：乙酰胆碱、Ca2+、儿茶酚胺、兴奋性氨基酸、5-羟色胺、组织胺、血小板激活因子等。Cae+是其中最受重视的一个因子。目前认为颅脑损伤后脑细胞内钙超载对继发性脑损伤的发生和发展起决定性的作用,也是多种情况卜细胞死亡的最后共同通路。继发性脑损伤以脑水肿为例,脑水肿作为继发于多种颅脑疾病的最终病理现象,其发病机制是血脑屏障受损、脑缺氧、颅内静脉压增高等因素导致脑组织中水分的运输和平衡失调,水电解质在脑细胞膜内外的分布失衡而引起水分在脑细胞内或细胞外的病理性蓄积,导致脑体积增加和颅内压增高综合征,已有研究证实血脑屏障的通透性增加和细胞膜钙通道开放、钙超载在创伤性脑水肿的发生发展中起重要作用。在病理情况下,如脑外伤、脑缺血时,Ca2+早期大量入侵,细胞内Ca2+浓度急骤增加200倍,激活膜磷脂酶A2和磷脂酶C,兴奋多价不饱和脂肪酸,导致花生四烯酸(AA)代谢瀑布,钙泵活性减退,线粒体ATP能量产生不足,促发突触膜末梢兴合性氨基酸递质大量释放,激活突触后膜NMDA受体操纵的Ca2+通道,使Ca2+浓度进一步持续升高,导致神经元水肿死亡。同时Ca2+内流增加导致生成更多的自由基,导致更多溶酶体溶解和酶的释放,加重磷酸盐和蛋白酶对膜的破坏,最终导致脑细胞完全损坏。细胞内Ca2+超载可通过多种途径导致并加重脑水肿。钙离子作为神经元胞内的重要信使,参与神经递质的合成与释放、神经兴奋性的维持、突触的可塑性及酶活动等多种细胞功能的调节,也参与缺血、缺氧及中毒性细胞死亡等病理过程。钙离子的信使作用是通过胞浆内外浓度差的改变来实现。在静息状态下,细胞内外存在着10,000倍左右的浓度差。细胞依靠六种机制来维持其胞内外Ca2+稳态。(1)细胞膜对Ca2+有着极低的通透性,细胞膜作为屏障,组织细胞外Ca2+顺离子梯度渗入细胞内。(2)细胞膜上的钙泵偶联ATP水解功能,将细胞内Ca2+主动泵出细胞外。(3)细胞膜的钠、钙交换系统,在正常情况下钠离子顺离子浓度梯度进入细胞内时,Ca2+则逆浓度差由细胞内到细胞外,病理情况下则运转方向相反。(4)线粒体和内质网对Ca2+的隔离作用,线粒体把氧化代谢产生的氢离子排出线粒体,同时将胞浆中的Ca2+转移至线粒体内,内质网钙泵则主动将细胞浆中的Ca2+摄入内质网中。(5)胞浆中一些蛋白质与阴离子和Ca2+结合。(6)胞浆膜内侧的磷脂极性端也具有和Ca2+结合的能力。当细胞受到刺激兴奋时,胞浆中Ca2+浓度由于细胞膜上Ca2+通道开放、细胞膜及胞浆中结合钙的释放、线粒体和内质网释放Ca2+,可使胞浆中的Ca2-浓度上升,形成钙超载。临床和实验研究已证实,在脑损伤后神经细胞内存在钙超载。有学者采用45Ca免疫自显影技术观察实验性颅脑损伤动物不同时程脑组织钙含量变化发现脑挫裂伤动物脑组织钙含量在伤后2小时即显著增高,在24小时左右达高峰,持续约48小时,以后逐渐下降。黄勇华等通过脑内注射胶原酶建立大鼠脑出血模型,用电镜细胞化学技术,观察到神经细胞及毛细血管的超微结构有肿胀表现,细胞内可见多量Ca2+颗粒。用钙拮抗剂治疗后,细胞病理变化显著减轻,钙分布明显减少。贺晓生等在脑弥漫性轴索损伤(DAI)模型中发现：受损髓鞘内有大量细小钙颗粒,髓鞘损害程度与钙颗粒数量呈正相关：伤后晚期轴浆内可见粗大钙颗粒。神经细胞胞体及血管内皮细胞空泡化,也有钙颗粒沉着,内皮细胞官腔面出现微绒毛。认为DAI中轴索存在Ca2+超载,是导致DAI发生发展的重要因素。周国胜等发现Mg2+通过抑制兴奋性氨基酸的作用,减少Ca2+内流,具有明显的脑保护作用。故在一定程度上,细胞内Ca2+变化是细胞死亡的最后的共同通路,是神经细胞继发性损伤的主要原因之一。脑外伤后引起神经元细胞浆内钙超载的具体原因目前仍不十分清楚。现在普遍认为脑外伤后细胞外Ca2+大量流入神经元内,是造成神经细胞钙超载的主要原因。细胞受刺激后大部分细胞外Ca2+主要经电压依赖性通道(VDCC)和受体操纵性通道(ROCC)进入胞质。除此以外,脑外伤后继发的脑缺血、缺氧、ATP减少、钙泵失活,线粒体、内质网滞留Ca2+作用降低,酸中毒时氢离子浓度增高,氢离子、钙离子竞争统一结合位点,导致结合钙释放增多(此时Ca2+的释出对酸中毒有缓和作用),都将导致胞质内Ca2+浓度继续升高。在胞质内,Ca2+结合到作为效应物的专一性蛋白质钙调蛋白(CaM)上,然后CaM便能与专门的酶结合,从而导致微管解聚,神经元骨架破坏；突触前膜、突触后膜蛋白质过度磷酸化；神经元内钙对细胞膜钾离子通透性调节功能丧失；神经元内钙含量升高能明星抑制细胞能量代谢。近年来有关钙离子代谢的相关研究已有很多,其中国外学者在对非洲蟾蜍及斑马鱼胚胎的研究中提到的W nt5a/Frizzled-2信号途径,亦称为非经典Wnt/Ca2+途径,与细胞内钙的关系引起了我们的注意。相关研究显示,Wnt是一类分泌性糖蛋白,得名于Wg(wingless)与Int,是胞外信号分子的一个大的组成家族,参与调控多种发育过程,如细胞分化、细胞极性、细胞迁移和细胞增殖。Wnt蛋白与Frizzled受体家族中相应受体结合激活不同的胞质内信号途径,Wnt信号途径主要包括经典Wnt信号途径(β-连环蛋白的信号途径)和非经典Wnt信号途径(Ca2+信号途径)。Wnts,包括Wntl、Wnt3和Wnt8都能激活经典Wnt途径。与之相反,Wnt5a调节的非经典Wnt途径触发细胞内Ca2+释放。随着对Wnt/Ca2+信号途径的深入研究,下游信号逐渐被发现,Kuhl和Sheldahl证实了Wnt5a和Frizzled-2诱导的Ca2+增加途径能激活两种已知的Ca2+敏感酶,Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ⅠI(CaMKII)和蛋白激酶C(PKC)。与之相反,激活Wnt/β-连环蛋白途径的Wnt8和Frizzled-1并不激活CaMKⅡ和PKC。已有研究者提出将CaMKⅡ活性检测(活化后为p-CaMKII)作为非经典Wnt信号途径标志物的观点。研究目的一些研究提出Wnt5a是通过激活Frizzled-2受体,导致Ca2+动员而发挥作用的。对斑马鱼和非洲蟾蜍的研究,为非经典Wnt/Ca2+途径提供了第一手的证据。在单个细胞斑马鱼胚胎中注射Wnt5a mRNA时发现胚层上钙变化频率增大两倍,这是第一次发现钙在Wnt信号途径中具有第二信使的作用。Frizzle-2是Wnt5a配体的细胞表面受体,在斑马鱼中异位表达大鼠Frizzled-2能使细胞内钙释放增加,研究提示Wnt5a经由Frizzled-2受体刺激钙离子释放。目前研究集中在阐述wnt和Frizzled在低等动物,比如非洲蟾蜍和斑马鱼细胞或组织中如何结合以及结合后下游信号途径的表达,但Wnt5a/Frizzled-2信号途径在哺乳动物神经细胞中的是否存在,如果存在那么如何激活?激活后是否也可以引起细胞或组织中的Ca2+变化却知之甚少。已知在正常生理情况下,细胞内钙是神经系统中重要的第二信使,调节不同的细胞功能,是维持细胞的正常状态的重要因素,是细胞之间及其与外界进行信息交流的重要介质。但在某些病理的情况下,比如创伤性颅脑损伤(TBI),细胞损伤后这种稳定状态就被打破,导致细胞内的钙离子积聚直至钙超载发生,最终导致细胞的死亡。综合以上资料,钙离子超载是TBI的主要机制之一,Wnt5a/Frizzled-2信号途径又与细胞内的钙离子变化有关,那么两者之间有没有什么联系呢?Wnt5a/Frizzled-2信号途径在创伤性脑损伤这样特定病理环境中有没有可能被激活,在脑损伤机制中又扮演着什么样的角色呢?方法和结果本研究从以上几点假设为出发,经体外和体内两部分研究,最终证明了Wnt5a/Frizzled-2信号途径在哺乳动物的神经细胞中同样存在,且在脑损伤后能够激活并参与到了损伤后神经细胞钙离子超载的过程中。第一部分实验中我们首先培养了大鼠海马星形胶质细胞,而后使用QRT-PCR和Western-blot分别检测了大鼠正常星形胶质细胞中Wnt5a和Frizzled-2的基因及蛋白质的表达,以及正常细胞中钙离子的含量,结果肯定了我们的假设和猜测；接下来为了证明此途径在某种条件下被激活后,对细胞内的钙离子含量的影响,我们利用全基因合成的frizzled-2质粒,结合Lipo2000将其转染至正常的星形胶质细胞内,发现Wnt5a和Frizzled-2无论在基因还是蛋白水平上都发生了明显的增高,并且检测到了此途径激活特异性标志蛋白p-caMKⅡ的表达,同时细胞内的钙离子含量随之也发生了显著的升高,结果具统计学意义。这说明细胞内的钙离子水平的变化与此途径的激活有一定的相关性。但,是这条途径在某种条件下激活后导致了细胞内的钙离子水平增高么?针对这一问题,我们使用Stealth RNAi靶向沉默frizzlea-2基因,抑制Frizzled-2蛋白质的表达,最终抑制Wnt5a/Frizzled-2信号途径的活性,然后观察细胞内的钙离子水平是否发生变化。结果再次证实了我们的假设,Wnt5a与Frizzled-2基因及蛋白的表达明显降低,与之呼应的是途径激活特异性标志蛋白p-caMK Ⅱ的表达和细胞内的钙离子含量也明显的降低了。这说明,Wnt5a/Frizzled-2信号途径在某种条件下激活后,能够引起大鼠星形胶质细胞中的钙离子含量增高。第二部分实验采用QRT-PCR和Western-blot两种方法分别从基因和蛋白质水平检测Wnt5a和Frizzled-2在不同处理条件下的大鼠海马组织中的表达情况。实验结果证实与体外实验相符,Wnt5a/Frizzled-2信号途径同样存在于正常大鼠的海马组织中。我们发现,随着损伤后Frizzled-2的表达增高,Wnt5a以及细胞内的钙离子水平与正常组织的检测值相比也相应地增高了数倍。通过对此途径激活的特异性标志蛋白钙依赖性蛋白激酶Ⅱ(caMKⅡ活化形式p-caMKⅡ)的表达检测发现,在脑损伤后,伤侧海马组织中p-caMKⅡ的表达量显著增高,这说明Wnt5a/Frizzled-2信号途径在脑损伤后激活了,并且与细胞中钙离子的增幅相关。为了进一步证明Wnt5a/Frizzled-2信号途径的激活参与了损伤后海马细胞的钙离子超载过程,我们针对frizzlea-2设计了特异性的抑制剂StealthRNAi,利用体内转染试剂将Stealth RNAi通过立体定向注射的方法靶向沉默海马组织中frizzled-2基因,观察大鼠在脑损伤后Wnt5a和Frizzled-2的基因及蛋白在海马组织中的表达情况。QRT-PCR和Western-blot检测发现,脑损伤后随着海马组织中frizzled-2基因的表达降低(沉默率达76%),Frizzled-2以及Wnt5a、(基因和蛋白)p-caMKⅡ的表达较之单纯损伤组大鼠海马组织中的检测值也非常显著的下降了,细胞中的钙离子荧光强度也随之减弱数倍。结论和意义结果提示：(1)Wnt5a/Frizzled-2信号途径首先存在于哺乳动物的神经细胞中(2)创伤性脑损伤能够激活Wnt5a/Frizzled-2信号途径,后者对损伤后神经细胞钙离子超载起到非常重要的作用。换句话说,Wnt5a/Frizzled-2信号途径在脑损伤后激活是脑损伤后神经细胞钙超载的可能机制之一。(3)本研究验证了Stealth RNAi体内转染靶向沉默目的基因的可行性,并且具有较高的抑制效率；通过对Wnt5a/Frizzled-2信号途径在创伤性脑损伤过程中的作用研究,将有助于对损伤机制的理解,为研究、治疗提供新的可能的靶点。