研究背景和目的恶性肿瘤是对人类健康的巨大威胁。目前全世界每年新发恶性肿瘤病例约有1000万人,因癌症导致死亡的病例约700万,其中中国就占了六分之一,恶性肿瘤已是我国第二位的死亡原因。胶质瘤占原发颅内肿瘤的40%-60%,年发病率5-10/10万。由于其病因、发病机制、临床表现尚未完全阐明,且胶质瘤具有高增殖率、高组织病理学变异性、广泛浸润性生长,现阶段常规的治疗手段为：以手术治疗为主,然后辅以放射治疗、化学治疗,有时加上免疫治疗和中医药治疗等一系列的综合治疗措施,虽然现代神经影像学等检查技术取得了长足的发展和术中肿瘤示踪技术的应用,但显微手术治疗仍很难保证肿瘤切除后的周围“正常”组织中无肿瘤细胞,以致术后复发率高,治疗效果不佳。恶性胶质瘤综合治疗后的平均生存期不足12个月,2年生存率为10%,严重威胁人类的健康。虽然国内外的医务工作者对此进行了大量的研究,但亦今为止胶质瘤的治疗仍是世界公认的难题。在治疗上,使用抗胶质瘤药物是主要的措施之一,其虽然对一些肿瘤已取得一定的疗效,但仍存在着对肿瘤细胞选择性差,免疫抑制及不良反应多而严重,产生耐药性等缺陷。近年来肿瘤基础和临床研究取得了很大的进展,其中开发新型抗肿瘤药物最重要的努力方向之一就是发展特异性杀伤肿瘤细胞的药物。因此,一种新型的肿瘤靶向治疗方法——免疫毒素应运而生。免疫毒素由“杀伤片段”和“导向分子”以一定的连接方法偶联而成。其“杀伤片段”部分即生物毒蛋白,来自植物或微生物,为酶催化型毒素,效率很高,理论上一个分子进入胞浆即能杀死细胞。理想的毒素载体应具有能与肿瘤细胞特异性结合,且与“杀伤片段”偶联后不影响彼此活性的特性。“导向分子”要求可以特异性识别肿瘤细胞,而对正常细胞没有作用,那么就可以只攻击肿瘤细胞,不攻击正常细胞。目前,单克隆抗体是主要的“导向分子”。然而,由于完整抗体分子量较大,难以穿透到实体肿瘤内部,因此科研工作者开始改造抗体。单链抗体虽然可以保持原有抗体的所有特性,但是容易产生聚集。单链抗体由于忽略了重链和轻链直接的相互作用,因此不能成为理想的引导分子。2007年,发表在nature biotechnology上一篇文章研究发现：分别从重链和轻链取出一个CDR (complementarity-determining regions),中间通过轻链的某一框架区域链接融合成的引导片段,作者证明该片段可以保留原抗体本身的特异性。基于此,我们想构建一个分子量明显减小,渗透性强,可以特异性杀伤神经胶质瘤细胞系U87的新融合工程多肽。本研究中,“杀伤片段”我们选择了可以抑制真核细胞蛋白质合成的白喉杆菌外毒素前面的388个氨基酸残基(DT388),将特异性识别U87的单克隆抗体的轻链CDR1(LCDR1)、重链框架FR2(HFR2)和重链CDR3(HCDR3)构成的抗体拟态LCDR1-HFR2-HCDR3为“导向分子”。采用基因工程方法将此二者构建出一个新的重组质粒pGEX-IT-87,将其转化到克隆菌JM109中扩增,采用大肠杆菌BL21进行蛋白表达。采用亲和层析法分离纯化融合多肽,至此,我们成功制出了治疗胶质瘤的“药物”—免疫毒素IT-87。以淋巴瘤细胞系Raji作为对照,观察免疫毒素IT-87的体外杀伤特异性及效率。采用重症联合免疫缺陷小鼠(SCID)荷瘤模型深入探讨该免疫毒素体内的靶向性和杀伤效率,为胶质瘤的免疫毒素治疗研究提供一些依据和策略。所涉及的统计学分析和处理采用SPSS13.0软件。第一部分免疫毒素IT-87的基因构建、表达及纯化目的：1.获得目的基因片段1(DT388基因)和目的基因片段2(VLCDR1-VHFR2-VHCDR3基因片段),进行重组质粒pGEX-IT-87的构建。2.扩增重组质粒pGEX-IT-87,转化进入大肠杆菌BL21,构建出表达菌株。3.表达融合多肽,并对其进行分离、纯化,制造出免疫毒素IT-87。方法：1.目的基因片段1(DT388基因)的获取：对含目的基因片段1(DT388基因)的载体质粒pGEX-T进行双酶切,经琼脂糖凝胶电泳分离目的基因,然后胶回收、鉴定,得到目的基因片段1。2.克隆载体质粒pGEX-T的提取及电泳鉴定：取携带克隆载体质粒pGEX-T的菌液,经试剂盒小量抽提质粒,同时质粒琼脂糖凝胶电泳检测质粒质量。3.重组质粒pGEX-DT388的构建：对克隆载体质粒pGEX-T进行双酶切,克隆载体vector1双酶切后的琼脂糖凝胶电泳,经胶回收、鉴定,与目的基因片段1(DT388基因)连接,获得重组质粒pGEX-DT388。4.目的基因片段2(VLCDR1-VHFR2-VHCDR3)的获取：对含目的基因片段2的质粒pGEX-T进行双酶切,经琼脂糖凝胶电泳分离目的基因,然后进行胶回收、鉴定,得到目的基因片段2。5.重组质粒pGEX-IT-87{含重组DT388-(VLCDR1-VHFR2-VHCDR3)基因}的构建：对重组质粒pGEX-DT388进行双酶切,经琼脂糖凝胶电泳、胶回收纯化、鉴定,然后与目的基因片段2连接,获得重组质粒pGEX-IT-87。6.扩增重组质粒pGEX-IT-87:制备克隆菌JM109感受态,将重组质粒pGEX-IT-87转化进入克隆菌,对克隆菌阳性鉴定。7.重组质粒pGEX-IT-87转化进入表达宿主菌：制备表达菌BL21感受态,将重组质粒pGEX-IT-87转化进入BL21菌。8.融合蛋白(免疫毒素IT-87)的表达、分离纯化、鉴定：(1)活化阳性表达菌菌种,接种于培养基,诱导蛋白表达,收集菌体、超声破菌,进行蛋白的收集,通过Ni亲和层析柱将蛋白纯化(冰上)。(2)蛋白浓度测定(BCA试剂盒法)(3)融合蛋白的鉴定：将融合蛋白进行SDS-PAGE,分析分子量。9.放大试验：扩大表达菌的培养,诱导蛋白表达,收集菌体、超声破菌,收集蛋白,通过Ni亲和层析柱将蛋白纯化(冰上),冰冻保存用于后继实验。结果：1.通过对含目的基因片段1(DT388基因)的质粒pGEX-T进行双酶切,琼脂糖凝胶电泳分离目的基因,胶回收、鉴定,得到目的基因片段1；同法对含目的基因片段2(VLCDR1-VHFR2-VHCDR3基因)的质粒pGEX-T处理得到目的基因片段2。2.通过对克隆载体质粒pGEX-T的双酶切,酶切后的电泳、胶回收及鉴定,与目的基因片段1(DT388的基因)连接,获得重组质粒pGEX-DT388,然后再跟目的基因片段2连接,构建出目的重组质粒pGEX-IT-87。3.重组质粒pGEX-IT-87经过在JM109中的扩增,转入BL21感受态细胞后经IPTG诱导产生大量包涵体,超声裂解细菌释放包涵体,Ni亲和层析柱纯化包涵体；经过稀释复性与超滤浓缩后,获得了一定量高纯度的融合蛋白(免疫毒素IT-87)。经测定融合蛋白浓度约为1.3mg/ml。结论：通过对含目的基因片段1(DT388基因)的质粒pGEX-T进行双酶切,琼脂糖凝胶电泳分离目的基因,胶回收、鉴定,得到目的基因片段1；同法得到目的基因片段2；两者经一系列的分子生物学技术处理得到重组质粒pGEX-IT-87,经过在JM109菌中的扩增,转入BL21感受态细胞后经IPTG诱导产生大量包涵体,超声裂解细菌释放包涵体,Ni亲和层析柱纯化包涵体；经过稀释复性与超滤浓缩后,获得了一定量高纯度的融合蛋白(免疫毒素IT-87),可用于后继的体外、体内实验。第二部分免疫毒素IT-87对肿瘤细胞靶向杀伤作用的体外研究目的：以Raji细胞(人Burkitt淋巴瘤细胞)为对照,在体外观察免疫毒素IT-87对U87MG细胞(人胶质母细胞瘤细胞)杀伤的靶向性和效果。方法：分别将处于对数生长期的Raji细胞和U87MG细胞接种到24孔板内。按照实验预先设定,向实验孔内分别加入100ul从10-9M到10-6M的IT-87融合蛋白。培养24h后,分别向细胞中加入100μl吖啶橙(AO)和碘化丙啶(PI)进行双染色,用荧光显微镜观测490nm激发波长可同时观察活细胞和死细胞,545nm激发波长仅可观察到死细胞。对活细胞和死细胞进行计数。采用每孔取5个视野,每个视野计数100个细胞中活细胞个数,活细胞数除以总细胞数,即为存活率。用SPSS13.0软件采用析因设计进行统计学分析,P<0.05为有统计学意义。结果：通过对指数生长期的U87MG肿瘤细胞和Raji肿瘤细胞进行吖啶橙(AO)和碘化丙啶(PI)的双染色后,用荧光显微镜观测细胞,对活细胞和死细胞进行计数,发现在浓度≥10-7M时,IT-87杀死了90%的U87MG细胞；相反,IT-87甚至在最大浓度10-6M试验时,仅能杀死少量Raji细胞。经统计学分析,结果显示细胞和浓度存在交互作用(F=1329.298,P=0.000),各浓度之间存在主效应(F=1419.347,P=0.000),两个细胞之间有差别(F=9524.386,P=0.000)。U87细胞四个浓度之间有差别(F=1590.179,P=0.000),各浓度两两比较均有差异(均P=0.000), RAJI细胞四个浓度之间有差别(F=12.769,P=0.000),10-6M与其它浓度有差异(均P=0.000),其他浓度没有差异(P>0.05),10-9M浓度两细胞没有差异,其他浓度两细胞均有差异(P=0.000)。说明免疫毒素IT-87在很低浓度时(10-9M),对两种细胞杀伤作用弱,两者比较没有差异(P>0.05)；而在其它浓度时,IT-87对U-87MG细胞有明显的杀伤作用,其杀伤作用随着IT-87的浓度增高而增大,在10-6M时几乎杀死所有U-87MG细胞；而对Raji细胞来说,IT-87对其杀伤作用不明显,只有在药物浓度很大时(10-6M),才杀死少量细胞,与U-87MG细胞相比有明显差异(P=0.000)。结论：在体外细胞杀伤实验中,免疫毒素IT-87在很低浓度时(10-9M),对两种细胞杀伤作弱,两者比较没有差异(P>0.05)；而在其它浓度时,IT-87对U-87MG细胞有明显的杀伤作用(F=1590.179；P=0.000),其杀伤作用随着IT-87的浓度增高而增大,在10-6M时几乎杀死所有U-87MG细胞；而对Raji细胞来说,IT-87对其杀伤作用不明显,只有在药物浓度很大时(10-6M),才杀死少量细胞,与U-87MG细胞相比有明显差异(F=9524.386,P=0.000),表现出了IT-87对U87MG细胞的杀伤靶向性及杀伤的有效性。第三部分免疫毒素IT-87肿瘤靶向治疗作用的体内研究目的：1.用SCID小鼠建立U87MG和Raji荷瘤模型。2.以Raji荷瘤模型为对照,观察免疫毒素IT-87对小鼠荷瘤模型U87MG肿瘤生长的抑制作用。3.通过体内示踪技术,观察免疫毒素IT-87对U87MG肿瘤的靶向特异性。方法：1.动物分组：使用30只5周龄小鼠(体重18±2g),随机分成对照组(n=12),治疗组(n=12)和成像组(n=6)。2.荷瘤模型的建立：在小鼠两侧相当于腋窝的部位,各取100ulRaji和U87MG细胞悬液(浓度均为5x107个/ml)通过皮下注射方式接种于每只SCID小鼠的左右两侧。3.荷瘤模型的的杀伤实验：(1)药物剂量的筛选：依据体外实验的结果,采用9只小鼠分3组(称为A、B、C组,每组n=3),相应地分别采用150ug/只、300ug/只、750ug/只(腹腔内注射)三个不同剂量的免疫毒素进行了为期10天的预实验。结果发现300ug/只的效果比较明显,且注射剂量适中,动物反应较小。因此我们以300ug/只作为治疗剂量进行正式实验研究。(2)在肿瘤细胞注射第8天,将30只荷瘤小鼠随机分成对照组(n=12),治疗组(n=12)和成像组(n=6)。于分组当日开始注药(或对照剂),隔日在同一时间点向治疗组小鼠腹膜内注射免疫毒素IT-87,300μg/只,共10次；对照组小鼠则注射等量的融合多肽空白保存液(10mM PBS+0.2M NaCI磷酸盐缓冲液,治疗(处理)后,放回SPF级动物房继续饲养。于肿瘤细胞注射第10、14、18、22、26天处理前先用游标卡尺测量肿瘤最大径及最小径的值,并按公式V=4/3πx(d/2)2x(D/2)计算每次测量的肿瘤体积,d代表肿瘤最小径的值,D代表肿瘤最大径的值,绘制肿瘤体积增长曲线。(3)治疗(处理)结束后,颈椎脱臼术处死荷瘤小鼠,剥离肿瘤,称重,记录。4. SCID小鼠皮下荷瘤模型的体内示踪实验：用异硫氰酸荧光素(FITC)标记IT-87。成像组(n=6)小鼠在肿瘤细胞注射8天后,向腹膜内注射一次连接了异硫氰酸荧光素(FITC)的IT-87,每只注射150ug。用NightOWLIILB983成像系统动态观察即刻、1h,2h,3h,4h,6h动物体内荧光变化以了解FITC-IT-87在小鼠体内的的分布情况。5.统计分析使用SPSS13.0(IBM, Armonk, NY),所有数据重复测量3次。小鼠肿瘤体积增长比较的统计方法采用重复测量方差分析；小鼠肿瘤重量比较采用t-test来检测,p值<0.05认为有统计学差异。结果：1.用SCID小鼠成功建立了U87MG和Raji荷瘤模型。2.小鼠肿瘤体积增长曲线：使用SPSS13.0软件,统计方法采用重复测量方差分析,结果显示U87MG细胞和时间存在交互作用(F=1948.941,P=0.000),各时间之间存在主效应(F=10061.468,P=0.000),U87MG治疗组和对照组之间有差别(F=10022.335,P=0.000)。U87MG细胞时间之间有差别(F=1376.517,P=0.000),对照组各时间有差异(P=0.000),除第10天外其他时间均有差异(P=0.000)。即随着时间的推移,U87MG治疗组和对照组的肿瘤体积都在增大,但从第14天(第2次测量)开始,治疗组肿瘤体积增长明显慢于对照组,说明IT-87对U87MG诱导的肿瘤增长有明显的抑制作用。另一统计结果显示Raji肿瘤和时间不存在交互作用(F=2.016,P=0.153),时间之间存在主效应(F=5262.131,P=0.000),Raji治疗组和对照组之间无差别(F=2.031,P=0.168)。Raji肿瘤治疗组各时间之间有差别(F=1409.127,P=0.000),对照组肿瘤各时间之间有差别(F=15007.188,P=0.000),各时间两组均没有差异(P>0.05)。即随着时间的推移,Raji细胞诱导的肿瘤治疗组和对照组的体积都在增大,两者体积增长速度一致,说明IT-87对Raji细胞诱导的肿瘤增长无抑制作用。3.治疗组小鼠经腹腔内注射IT-87,300μg/只,共10次；对照组小鼠则注射等量的融合多肽空白保存液(10mM PBS+0.2M NaCI磷酸盐缓冲液)。结果显示免疫毒素IT-87显著抑制了治疗组荷瘤小鼠U87MG肿瘤的生长(平均瘤体重量=1.46[±0.67]比4.29[±0.87]g；t=8.883,p<0.0001)；说明IT-87对U87MG肿瘤有杀伤作用。而治疗组和对照组的Raji肿瘤大小没有统计学差异(平均瘤体重量=4.03[±1.33]比4.10[±1.05]g；t=0.138,p=0.892,p>0.05),说明IT-87对Raji肿瘤没有杀伤作用。4.成像组(n=6)小鼠经腹膜内注射IT-87后,影像结果显示IT-87分子在注射(150μg [IP]/小鼠)1-2小时后渗透入U87MG细胞诱导所致的肿瘤,3-4小时后逐渐积累在肿瘤核心；注射6小时后,这些物质几乎积满整个肿瘤。最终,IT-87分子可以在这些肿瘤里面或周围找到。相反,没有IT-87分子积累在Raji细胞所致的肿瘤里面或周围。说明免疫毒素IT-87对U87MG肿瘤有靶向特异性。结论：实验结果显示U87MG治疗组和对照组之间肿瘤体积增长有差别(F=10022.335,P=0.000),即IT-87对U87MG诱导的肿瘤增长有明显的抑制作用,而Raji治疗组和对照组之间无差别(F=2.031,P=0.168),即对Raji细胞诱导的肿瘤增长无抑制作用。免疫毒素IT-87显著抑制了治疗组荷瘤小鼠U87MG肿瘤的生长(平均瘤体重量=1.46[±0.67]比4.29[±0.87]g；t=8.883,p<0.0001)；说明IT-87对U87MG肿瘤有杀伤作用。而治疗组和对照组的Raji肿瘤大小没有统计学差异(平均瘤体重量=4.03[±1.33]比4.10[±1.05]g；t=0.138,p=0.892,p>0.05),说明IT-87对Raji肿瘤没有杀伤作用。成像组小鼠经腹膜内注射IT-87(150μg[IP]小鼠)后,影像结果显示IT-87分子在注射3-4小时后逐渐积累在U87MG肿瘤核心；而Raji诱导的肿瘤里面或周围却没有。显示免疫毒素IT-87对小鼠荷瘤模型U87MG肿瘤生长有显著的抑制作用,并且有显著的杀伤靶向特异性,提示其具备潜在的临床应用前景。