疱疹病毒可表达多种不同长度和结构的非编码RNA，其中EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)转录表达两种被称为EBERs(EBV-encoded RNAs)的小RNA和几种微小RNA(microRNAs, miRNAs)，EBERs是在所有EBV相关疾病及潜伏感染细胞中表达最为丰富的转录本。体外几乎所有EBV感染细胞中都能检测到EBERs的转录表达，因此在临床样本中通常被用作检测EBV感染的金标准。EBERs在体内及体外细胞培养中均可对细胞生长及其生理功能产生广泛影响，尽管大量EBERs在EBV感染潜伏期表达并具有重要功能，但其体内生物学功能及其作用的分子机制并未被阐明。目前数据库中两份EBER相关高通量测序结果显示，EBER过表达前后共有2000条左右差异表达基因，功能注释分类表明这些基因涉及多种细胞生物学功能和信号传导通路，其中多个信号通路与肿瘤相关。但两份报告差异表达基因种类和差异倍数不尽相同，且仅在淋巴瘤中进行了检测，尚未见上皮细胞中EBER基因作用的高通量检测分析相关研究报道。Ⅰ型干扰素(interferons, IFN)是宿主免疫对抗肿瘤的关键成分，Ⅰ型干扰素对治疗癌症过程中的免疫反应起着关键作用。尽管数据显示EBER与干扰素相关基因有关，但具体生物学机制仍未被阐明。　　目的：　　①建立成功敲除EBERs基因的EBV阳性鼻咽癌细胞系C666-1和 EBER1基因过表达的SGC7901细胞系。　　②细胞学实验检测EBER敲除及过表达前后细胞迁移、增殖及凋亡等细胞生物学行为改变。　　③高通量测序分析筛选出C666-1细胞系EBER基因敲除或SGC7901细胞系过表达前后差异表达基因以及SNP和缺失位点。　　④通过对差异表达基因的富集分析，筛选出EBER相关的分子通路以及靶点。　　⑤对部分差异表达基因进行验证和比较分析，深入研究EBER可能的作用机制，为阐明EBER表达在EBV相关肿瘤中致病机制提供实验基础和理论依据。　　方法：　　①CRISPR/Cas9 双载体慢病毒转染鼻咽癌细胞系 C666-1 ， EBER1 过表达pcDNA3.1-EGFP质粒载体转染胃癌细胞系SGC-7901，使用流式细胞术分选携带荧光的细胞，并采用有限稀释法筛选获得单克隆目的细胞系。　　②对上述细胞系及其对照细胞系进行生物学表型检测，采用细胞划痕实验和Transwell迁移实验检测细胞迁移能力，CCK8实验检测细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞凋亡情况。　　③采用高通量转录组测序技术对上述细胞系及其对照细胞系进行转录组测序，生物信息学技术对测序数据进行分析，包括测序数据的预处理、基因组比对、SNP分析、差异表达基因分析、差异基因mRNA GO(Gene Ontology)富集分析、差异基因mRNA KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 富集分析以及EBV表达基因分析。　　④提取EBV阴性肿瘤细胞系(SGC7901, BGC823, HGC27, AGS, CNE, HONE)、EBV阳性肿瘤细胞系(GT38, GT39, SNU719, C666-1)以及EBER基因成功敲除及过表达细胞系和对照细胞系总RNA和总蛋白，采用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)对转录组测序筛选出的部分表达差异基因(ADAR, CASP11, PML, IFR3, IFR7, IFR9, PKR, ISG60, ISG15, PRKRA, MX1, 2’5OAS)的转录表达进行验证。　　⑤选取一条富集分析筛选出差异表达基因分布较集中的通路，即干扰素相关分子通路进行深入研究，采用实时荧光定量PCR检测该通路关键调节分子IKKε和PIAS1基因转录表达，Western Blot检测分析STAT1, IRF9蛋白表达水平，Western Blot和免疫荧光法相结合分析STAT1蛋白磷酸化状态。　　⑥采用IFN-α分别作用于EBV阴性胃癌细胞系(SGC7901, BGC823, HGC27，AGS)， EBV阳性细胞系(GT38, GT39, SNU719)，EBER基因敲除或过表达细胞系及其对照细胞系，并提取细胞总RNA；采用实时荧光定量PCR检测IFN-α处理后细胞系差异表达基因(ADAR, CASP11, PML, IFR3, IFR7, IFR9, PKR, ISG60, ISG15, PRKRA, MX1, 2’5OAS)以及干扰素相关分子通路调节分子(IKKε，PIAS1)的表达水平。　　⑦采用CCK8实验检测IFN-α作用后的EBER基因敲除或过表达细胞系及其对照细胞系细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞凋亡情况，并进行统计学分析。　　⑧采用t检验分析不同细胞系间各基因表达水平的差异、细胞增殖能力、凋亡等数据，并使用SPSS 20.0软件对数据进行统计学分析，P<0.05为差异有统计学意义。　　结果：　　①成功筛选出EBER1敲除的C666-1细胞系(C666-1-EBER1-KO) ， EBER1和EBER2同时敲除的C666-1细胞系(C666-1-EBERs-KO1, 2)，EBER1过表达的SGC7901细胞系(SGC7901-EBER1-D5, E7, G7)。敲除EBER2的C666-1细胞系构建失败。　　②EBER敲除或过表达对细胞增殖能力，迁移能力以及细胞凋亡无明显影响。　　③转录组高通量测序质量控制各项指标均符合要求，EBER敲除C666-1单克隆细胞、EBER1过表达SGC7901单克隆细胞及其对照细胞系高通量转录组测序结果显示， 3 组 SGC-7901 对照细胞有 106,058、99,261 和 87,304 个 SNPs 出现，而 3 组SGC-7901-EBER1过表达细胞克隆分别有149,763、180,313和179,106个SNPs出现；过表达EBER1的细胞克隆SNPs及位点缺失明显多于对照细胞系(P<0.05)。而EBER敲除前后细胞系中SNPs及位点缺失无明显差异；各组细胞系可变剪切数量及类型无明显差异。　　④与对照细胞SGC7901-NC比较，过表达EBER1基因后，SGC7901-EBER1细胞系共有160条差异表达基因，其中107条基因表达上调， 53条基因表达下调。与C666-1-NC比较，EBER1基因敲除后，C666-1-EBER1-KO共有84条差异表达基因，其中61条基因表达上调，23条基因表达下调；EBER1和EBER2基因共同敲除后， C666-1-EBERs-KO共有108条差异表达基因，其中33条基因表达上调，75条基因表达下调。与C666-1-EBER1-KO相比，C666-1-EBERs-KO共有36条差异表达基因，其中1条基因表达上调，35条基因表达下调。　　⑤差异表达基因KEGG分析结果显示，差异表达基因主要参与部分肿瘤通路、体内代谢途径、病毒感染途径、免疫系统疾病通路等。KEGG富集分析显示EBER基因可能参与多条肿瘤相关途径，如Wnt信号通路、TGF-beta 信号通路、肿瘤途径、结肠癌、免疫相关疾病等途径。　　⑥EBV阳性胃癌细胞系(GT38, GT39, SNU719)中CASP11, PML, IFR7, IFR9, PKR, ISG60, ISG15, 2’5OAS 基因表达水平明显低于在 EBV 阴性胃癌细胞系(SGC7901, BGC823, HGC27, AGS) (P<0.05)，而在EBV阳性鼻咽癌细胞系和EBV阴性鼻咽癌细胞系上述基因的表达无显著性差异(P>0.05)。　　⑦C666-1-EBER1-KO，C666-1-EBERs-KO细胞系与其对照细胞系C666-1-NC比较，所测干扰素刺激基因表达均无明显差异。与对照细胞SGC7901-NC比较，EBER1过表达的SGC7901-EBER1细胞ADAR, CASP11, PML, IFR7, PKR, ISG60, ISG15, PRKRA, 2’5OAS基因表达下调，差异具有统计学意义(P<0.05)。　　⑧各细胞系中，干扰素通路调控因子(IKKε, PIAS1)的表达水平均无明显差异(P>0.05)。EBVaGC细胞系与EBVnGC细胞系中，EBER基因敲除及过表达前后细胞STAT1, IRF9蛋白水平，STAT1磷酸化蛋白水平均无明显差异。免疫荧光检测结果显示EBER1过表达前后，SGC7901-EBER1及其对照细胞系SGC7901-NC中STAT1磷酸化及入核均无明显变化。　　⑨采用20ng/ml IFN-α处理EBER基因敲除、过表达细胞系及其对照细胞系，连续作用7天，CCK-8检测结果显示，EBERs敲除细胞系及对照细胞系在干扰素作用下表现出明显的生长抑制现象(P<0.05)。SGC7901-NC 生长抑制率曲线始终高于SGC-7901-EBER1，且从第4天开始，该差异具有统计学意义(P<0.05)。　　⑩流式细胞分析结果显示，IFN-α作用前后C666-1-EBERs-KO，C666-1-EBER1-KO及对照细胞C666-1-NC早期凋亡细胞百分比无明显差异(P>0.05)，SGC7901-NC细胞系早期凋亡细胞百分比及中晚期凋亡细胞均高于SGC7901-EBER1细胞系(P<0.05)。　　采用 20ng/ml IFN-α处理 EBV 阴性胃癌细胞系(SGC7901, BGC823, HGC27, AGS) ， EBV 阳性胃癌细胞系(GT38, GT39, SNU719) ， C666-1-EBER1-KO 及SGC7901-NC细胞系，实时荧光定量PCR结果显示，20ng/ml IFN-α处理前后，EBVaGC细胞系中多数干扰素刺激基因表达无明显变化(P>0.05)，EBVnGC细胞中干扰素刺激基因较处理前均有不同程度的表达上调(P<0.05)。比较20ng/ml IFN-α处理后的△△CT值， EBVnGC 细胞系中 CASP11, PML, IFR7, IFR9, PKR, ISG60, ISG15, PRKRA, MX1, 2’5OAS基因表达量升高倍数明显高于EBVaGC细胞系(P<0.05)。　　IFN-α处理后，在EBVaGC细胞系(GT38, GT39, SNU719)、EBVnGC细胞系(HGC-27, BGC823, SGC7901, AGS)，过表达EBER1细胞系(SGC7901-EBER1)及其对照细胞系(SGC7901-NC)中，干扰素通路调控因子(IKKε，PIAS1)表达水平变化不明显，组间比较无统计学差异(P>0.05)。　　结论：　　①EBER基因敲除或过表达后出现特异性表达差异的基因，GO富集分析和KEGG分析显示这些基因参与到特定的细胞功能和信号途径，提示EBER可能通过多种作用机制参与EBV相关肿瘤的发生发展。　　②EBER1过表达可导致SGC7901细胞出现大量SNPs及缺失，提示EBER参与基因结构发生改变的过程。　　③EBER1过表达前后多种干扰素刺激基因表达差异明显，且与EBV阴性和阳性细胞系中结果吻合，提示EBER1基因对干扰素刺激基因表达有调控作用。　　④表达EBER基因的细胞可部分抵抗干扰素上调干扰素刺激基因表达的作用，并抵抗干扰素对细胞的促凋亡作用。　　⑤EBERs调控干扰素刺激基因表达的机制并非是通过干扰素通路中调节因子IKKε和PIAS1抑制或影响STAT1磷酸化与入核。　　⑥EBERs对干扰素通路的抑制作用可能发生于ISGF3活化后的效应阶段。