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目的:肺纤维化(pulmonary fibrosis, PF)是一种慢性进行性的肺间质疾病,其特征是细胞外基质(主要是胶原纤维)在肺间质过度积聚。现已公认,基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase)和其组织抑制因子(tissue inhibitor of metaloproteinases)的失衡,是肺纤维化的发病机制之一。研究发现,各种原因引起的肺泡上皮细胞损伤均可暴露基底膜,而基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)即Ⅳ型胶原酶,可以降解基底膜,使基底膜和肺泡隔中形成许多空隙,有利于激活的成纤维细胞向肺泡隔空隙中迁移和增殖,导致肺泡隔增厚。基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13, MMP-13)又称胶原酶3,主要降解Ⅰ～Ⅲ型胶原,并具有明胶酶样作用,是鼠类主要的间质胶原酶。TIMPs可以抑制MMPs的活性,因此,MMP-9、MMP-13与TIMPs的失衡参与了肺泡炎形成,肺基底膜破坏及肺纤维化形成过程。博莱霉素(bleomycin, BLM)是一种常见的抗肿瘤化疗药,其毒副作用主要是引起亚急性肺泡炎和肺间质纤维化。气管内滴注BLM是公认的复制肺纤维化模型方法。我课题组以往研究结果显示,腹腔注射诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)抑制剂氨基胍(aminoguanidine, AG)20 mg/kg.d可以有效的防治BLM导致的PF,但是其作用机制尚待研究。AG能否通过改善PF形成过程中MMP-9、MMP-13及TIMPs的失衡,而起到防治肺纤维化的作用,迄今尚未见报道。本实验通过分别观察AG对BLM诱导大鼠PF早期(1-14d)和晚期(14-28d)肺组织匀浆中MMP-9、MMP-13含量和活性及TIMPs活性的影响,旨在阐明AG防治肺纤维化的可能机制,并为此药的临床应用提供实验资料。方法:明胶酶谱法检测MMP-9、MMP-13含量和活性;反义酶谱法检测TIMPs活性;用天狼猩红组化染色法和肺组织羟脯氨酸(hydroxyproline, HYP)含量测定法,判断肺纤维化的程度;用HE染色观察形态学变化,并辅助天狼猩红染色的肺间质胶原的定位。将58只健康清洁级Sprague-Dawley(SD)(♂)(体重170-180g)大鼠随机分为三组:1.动态观察组(n=12):分7d(n=4),14d(n=4)和28d (n=4)3个时间点。大鼠分别于气管内一次性滴注BLM(5 mg/kg)或NS(0.5 ml/kg)后第8 d、15和29 d被处死取肺,用于检测MMP-9、MMP-13及TIMPs的活性。2.早期给药组(即1-14d给药组)(n=16):其中14dNS+14dNS大鼠(n=3)于气管内一次性滴注NS(0.5 ml/kg)后,每天腹腔注射NS(1 ml/kg),连续14d;14dM+14dNS大鼠(n=8)于气管内滴注BLM(5 mg/kg)后,每天腹腔注射NS(1 ml/kg),连续14d;14dM+14dAG大鼠(n=5)气管内滴注BLM(5 mg/kg)后,每天腹腔注射AG(20 mg/kg.d),连续14d。此组大鼠于气管给药后第15 d取肺,肺组织分别用于MMP-9、MMP-13含量和活性及TIMPs活性的检测以及形态学观察(天狼猩红和HE染色)。3.晚期给药组(即14-28d给药)(n=30):其中28dNS+后14dNS大鼠(n=9)在气管内一次性滴注NS(0.5 ml/kg)后第14d至28d期间,每天腹腔注射NS(1 ml/kg);28dM+后14dNS大鼠(n=10)在气管内一次性滴注BLM(5 mg/kg)后第14d至28d期间,每天腹腔注射NS(1 ml/kg);28dM+后14dAG大鼠(n=11)于气管内一次性滴注BLM(5 mg/kg)后第14d至28d期间,每天腹腔注射AG(20 mg/kg.d)。大鼠均在气管滴注后第29d取肺,分别用于MMP-9、MMP-13含量和活性的检测及TIMPs活性的检测、形态学观察(天狼猩红染色和HE染色)以及羟脯氨酸含量测定。JEDA-801D形态学图像分析系统计算肺组织胶原天狼猩红染色的阳性面积百分比;Alpha FC凝胶成像分析软件分析MMP-9、MMP-13含量和活性及TIMPs活性。采用SPSS-13.0统计软件,MMP-9、MMP-13及TIMPs数据通过秩转换结合完全随机设计方差分析来进行组间差异的两两比较,以P<0.05作为判断差异显著性的标准。HYP和胶原含量的所有数据用均数±标准差(x±SD)表示,采用SPSS-13.0统计软件,多个样本均数比较用单因素方差分析(One-Way ANOVA),多个样本均数间的两两比较用最小显著差法(least significant difference, LSD),以P<0.05作为判断差异显著性的标准。结果:1.一般情况观察:NS+ NS大鼠活泼,反应灵敏,皮毛光滑。各BLM+NS大鼠活动迟缓,毛发晦暗竖立,并伴有喘息,食欲差,体重低。早期和晚期给予AG的大鼠食欲、毛色、体重及活动情况较BLM+NS大鼠均有好转。2.肺纤维化形成中肺MMP-9、MMP-13及TIMPs活性的变化:与NS大鼠相比,BLM大鼠肺MMP-9、MMP-13两者活性在气管滴注BLM后第7d即有升高,14d达到高峰,此后开始下降。二者不同的是,第28d MMP-9活性仍高于NS对照大鼠,而MMP-13活性却低于NS大鼠;TIMP-1活性在气管滴注BLM后第7d升高,第14d,28d时均低于NS对照大鼠。TIMP-2/3活性在气管滴注BLM后第7d低于NS对照大鼠,14d升高,第28d时低于NS对照大鼠。3. AG对肺纤维化形成早期和晚期肺MMP-9、MMP-13含量和活性及TIMP-1活性的影响3.1早期给药(1-14d)对肺MMP-9、MMP-13含量和活性及TIMPs活性的影响:与14dNS+14dNS大鼠相比,14dM+14dNS大鼠肺MMP-9、MMP-13含量均升高(均P<0.05),活性均增强(均P<0.01);TIMPs活性无明显变化(P>0.05)。与14dM+14dNS大鼠相比,14dM+14dAG大鼠MMP-9的含量降低(P<0.05),活性减弱(P<0.01);MMP-13含量降低(P<0.05),但其活性的变化尚无统计学意义(P>0.05);TIMPs活性的变化亦无统计学意义(P>0.05)。14dM+14dAG大鼠MMP-9含量、活性; MMP-13含量及TIMP-1、TIMP-2/3活性与14dNS+14dNS大鼠相比均无统计学意义(P>0.05)。3.2晚期给药(14-28d)对肺MMP-9、MMP-13含量和活性及TIMPs活性的影响:与28dNS+后14dNS大鼠相比,28dM+后14dNS大鼠肺MMP-9含量升高(P<0.001),活性增强(P<0.001);MMP-13含量降低(P<0.05),但其活性的变化无统计学意义(P>0.05);TIMPs的活性无明显变化(P>0.05)。与28dM+后14dNS大鼠相比,28dM+后14dAG大鼠,MMP-9含量降低(P<0.001),活性减弱(P<0.05);MMP-13含量升高(P<0.05),活性增强(P<0.05);TIMP-1和TIMP-2/3的活性均无统计学差异(均P>0.05)。与28dNS+后14dNS大鼠相比,28dM+后14dAG大鼠TIMP-1活性无明显改变(P>0.05),而TIMP-2/3活性明显增强(P<0.01)。4.AG对肺纤维化形成早期(1-14d)肺组织形态学(HE染色)及肺间质胶原面积的影响(天狼猩红组化法检测结果):4.1 HE染色结果:14dNS+14dNS大鼠肺结构正常,无炎症表现;14dM+14dNS大鼠肺泡间隔明显增宽,成纤维细胞和胶原基质明显增多,局部有肺实变;14dM+14dAG大鼠,上述形态学改变明显减轻。4.2天狼猩红组化法检测结果:14dNS+14dNS大鼠,14dM+14dNS大鼠和14dM+14dAG大鼠肺间质胶原面积百分比分别为(0.47±0.06),(1.04±0.06)和(0.53±0.05)。与14dNS+14dNS大鼠比较,14dM+14dNS大鼠肺间质胶原面积明显增大(P<0.001)。与14dM+14dNS大鼠比较,14dM+14dAG大鼠肺间质胶原面积明显减小( P<0.001 ) ,且与14dNS+14dNS大鼠的差异无统计学差异(P>0.05)。5. AG对肺纤维化形成晚期(14-28d)肺组织形态学(HE染色)及肺间质胶原的影响5.1 HE染色结果:28dNS+后14dNS大鼠肺结构正常,无炎症表现;28dM+后14dNS大鼠肺间质细胞数目明显增多,肺泡壁增厚,肺泡腔塌陷,肺泡融合,肺泡结构消失,局部有肺实变,间质纤维化瘢痕形成。与28dM+后14dNS大鼠比较,28dM+后14dAG大鼠上述形态学改变明显减轻。5.2天狼猩红组化法检测结果:28dNS+后14dNS大鼠、28dM+后14dNS大鼠和28dM+后14dAG大鼠肺间质胶原面积百分比分别为(0.46±0.01)、(1.8±0.11)和(0.49±0.06)。与28dNS+后14dNS大鼠比较,28dM+后14dNS大鼠肺间质胶原面积增大(P<0.001)。与28dM+后14dNS大鼠比较,28dM+后14dAG大鼠肺间质胶原面积明显减小(P<0.001),且与28dNS+后14dNS大鼠比无统计学差异(P>0.05)。5.3羟脯氨酸检测结果:28dNS+后14dNS大鼠、28dM+后14dNS大鼠和28dM+后14dAG大鼠肺HYP含量分别为[(3.65±1.05)μg/mg lung weight]、[(7.61±1.27)μg/mg lung weight]和[(4.86±1.51)μg/mg lung weight]。与28dNS+后14dNS大鼠比较,28dM+后14dNS大鼠肺HYP含量显著升高(P<0.001)。与28dM+后14dNS大鼠比较,28dM+后14dAG大鼠肺组织HYP含量显著降低(P<0.001),但仍高于28dNS+后14dNS大鼠(P<0.05)。结论:1.在肺纤维化的早期阶段(1-14d),AG完全阻止模型大鼠肺MMP-9含量增多,并阻止MMP-9活性的增强。同时阻止了MMP-13含量的增多,而对MMP-13及TIMPs活性变化无明显影响;并且,AG抑制肺泡间隔的增厚。由此推测,阻止模型大鼠肺MMP-9含量的升高和活性的增强是AG抑制肺泡间隔增厚,延缓肺纤维化进程的机制。2.在肺纤维化晚期阶段(14-28d),AG完全阻止了模型大鼠肺MMP-9含量增多和活性的增强,阻止了MMP-13含量降低和活性减弱,而对TIMPs的活性无明显影响。同时,AG阻止了模型大鼠肺间质胶原的堆积。由此推断,纠正肺纤维化晚期MMPs/TIMPs的失衡,是AG防治大鼠肺纤维化的作用机制。