目的:PDIA6是我们课题组前期运用二维凝胶电泳(2D-DIGE)结合质谱(MS),以非小细胞肺癌(NSCLC)及癌旁组织为研究对象,最终筛选并鉴定出在NSCLC组织中表达明显高于癌旁组织的差异表达蛋白。本研究旨在进一步阐明PDIA6在NSCLC中的生物学功能、分子机制和临床意义,期望为NSCLC诊断和治疗提供新的思路。方法:(1)PDIA6在NSCLC中表达及临床意义:a.采用Western blotting方法检测PDIA6在18对NSCLC组织和癌旁组织中表达,以及在正常肺细胞和NSCLC细胞中PDIA6的表达。b.利用免疫组织化学方法(IHC)检测NSCLC组织芯片中PDIA6的表达,并应用统计学方法分析其与NSCLC患者临床病理特征及生存预后关系。(2)细胞增殖检测:a.构建PDIA6过表达和干扰稳定细胞株。b.利用CCK8、平板克隆实验检测PDIA6对NSCLC体外增殖能力的影响。c.利用裸鼠成瘤实验检测PDIA6对NSCLC体内增殖能力的影响。(3)细胞凋亡检测:a.通过顺铂(Cisplatin)构建细胞凋亡模型,采用流式细胞术(FCM)、透射电子显微镜(TEM)、DAPI染色、Western blotting方法检测PDIA6对NSCLC细胞凋亡的影响。b.应用Caspase抑制剂Z-VAD-FMK(20μM)预处理细胞,通过AO/EB染色和Western blotting方法观察PDIA6对NSCLC细胞凋亡的影响。(4)细胞自噬检测:a.利用透射电子显微镜、单丹磺酰尸胺(MDC)染色、转染GFP-LC3质粒、Western blotting方法检测PDIA6对NSCLC自噬的影响。(5)PDIA6参与NSCLC细胞凋亡和细胞自噬的分子机制研究:a.通过磷酸激酶蛋白芯片、Western blotting、荧光素酶双报告、免疫荧光检测PDIA6对JNK/c-Jun细胞信号通路的影响。b.应用JNK信号通路抑制剂SP600125(20μM)预处理细胞,通过流式细胞术或mRFP-GFP-LC3双荧光自噬指示体系分别检测PDIA6对NSCLC凋亡和自噬的影响。c.应用抑制剂SP600125(20μM)或siRNA沉默JNK基因(siJNK)预处理细胞,通过Western blotting检测PDIA6对NSCLC凋亡和自噬相关蛋白的表达情况。d.利用Co-IP、Western blotting、激光共聚焦方法检测PDIA6与MAP4K1相互作用及共定位情况。e.应用siRNA方法沉默MAP4K1基因(siMAP4K1)预处理细胞,通过Western blotting方法检测MAP4K1/JNK/c-Jun细胞信号通路相关蛋白的表达情况。结果:(一)PDIA6在NSCLC中表达及临床意义与癌旁组织相比,PDIA6在NSCLC组织中的表达上调(p<0.05)。和正常肺细胞相比,PDIA6在NSCLC细胞中表达也明显增加(p<0.05)。结合组织芯片的临床病理特征,PDIA6与TNM分期(p=0.005)、组织类型(p=0.034)、淋巴结转移(p=0.019)有关,而与NSCLC患者的性别、年龄、肿瘤大小,及病理分级无关。高表达PDIA6的NSCLC患者比低表达患者的总生存期短(p=0.0043),且与TNM分期早期患者总生存期呈负相关(p=0.0386)。此外,PDIA6还具有作为NSCLC患者总体生存独立预后因素的潜能(p=0.009)。(二)PDIA6对NSCLC细胞增殖、凋亡和自噬的影响1.构建稳转细胞株利用A549细胞构建PDIA6过表达细胞模型,NCI-H520和Anip973细胞构建PDIA6干扰细胞模型。2.细胞增殖检测:(1)CCK8和平板克隆结果显示PDIA6具有促进NSCLC体外细胞增殖能力。(2)裸鼠成瘤实验证实PDIA6具有促进NSCLC体内细胞增殖能力。3.细胞凋亡检测:(1)DAPI染色和流式细胞术结果显示,PDIA6干扰组能够增加NSCLC细胞凋亡率(p<0.05),而PDIA6过表达组降低NSCLC细胞凋亡率(p<0.05)。(2)透射电镜结果显示,PDIA6干扰组细胞形态改变明显,伴随微绒毛的消失,细胞核碎裂,染色质凝集等现象。(3)Western blotting结果显示,PDIA6干扰组细胞中Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白表达量显著增加(p<0.05),Caspase-3、Caspase-9和Bcl-2蛋白表达量显著降低(p<0.05),而PDIA6过表达组细胞有相反的结果。同时,Caspase-8和Caspase-12在PDIA6过表达和干扰组细胞中均没有明显变化。(4)应用Z-VAD-FMK(20μM)预处理细胞,处理后PDIA6干扰组的细胞凋亡能力减弱。4.细胞自噬检测:(1)透射电镜结果显示,PDIA6干扰组细胞中自噬现象增加。(2)MDC染色结果显示,PDIA6干扰组中细胞染色强度增加,而PDIA6过表达组细胞染色强度降低。(3)转染GFP-LC3结果显示,PDIA6干扰组细胞中的点状聚集数目增多(p<0.05)。(4)Western blotting结果显示,细胞自噬相关蛋白LC3I/II,Beclin1,Atg5在PDIA6干扰组细胞中表达明显增加,SQSTM1/p62表达减少。同时,PDIA6过表达组有相反的结果。(三)PDIA6参与非小细胞肺癌细胞凋亡和细胞自噬的分子机制研究(1)磷酸激酶蛋白芯片结合Western blotting发现,PDIA6干扰组细胞中JNK和c-Jun磷酸化水平较高,而PDIA6过表达组有相反的结果。(2)荧光素酶双报告结果显示,PDIA6能够降低JNK/c-Jun信号通路活性。(3)免疫荧光结果显示,PDIA6干扰组细胞中c-Jun磷酸化水平明显增加,且以核内增加明显。(4)流式细胞术结果显示,经SP600125(20μM)预处理细胞,处理后PDIA6干扰组细胞凋亡率显著减少。(5)mRFP-GFP-LC3自噬指示体系结果显示,经SP600125(20μM)预处理细胞,处理后PDIA6干扰组细胞内红色(自噬溶酶体)、黄色(自噬体)的荧光斑点数均增多(p<0.05)。(6)经SP600125(20μM)或siJNK预处理细胞,处理后PDIA6干扰组细胞中p-JNK、LC3I/II及Cleaved caspase-3蛋白表达减少。(7)Co-IP 结合 Western blotting 鉴定出 MAP4K1 与 PDIA6 相互作用。(8)激光共聚焦结果显示,PDIA6与MAP4K1主要共定位在细胞浆。(9)Western blotting结果显示,PDIA6干扰组细胞中p-JNK、p-MKK7、p-TAK1和p-MAP4K1蛋白表达水平明显增加,而PDIA6过表达组有相反的结果。(10)应用siRNA方法沉默MAP4K1基因预处理细胞,处理后的PDIA6干扰组细胞中MAP4K1、p-MAP4K1和p-JNK蛋白表达明显减少。结论:(一)PDIA6在NSCLC中的表达及其临床意义1.PDIA6在NSCLC中表达上调。2.PDIA6的表达与NSCLC患者的淋巴结转移和TNM分期呈正相关。3.PDIA6的表达与NSCLC患者生存时间呈负相关。4.PDIA6可作为NSCLC患者总体生存独立预后因素。(二)PDIA6对NSCLC细胞增殖、凋亡和自噬的影响1.PDIA6促进NSCLC的细胞增殖。2.PDIA6通过内源性凋亡途径抑制NSCLC的细胞凋亡。3.PDIA6抑制NSCLC的细胞自噬有助于抑制细胞凋亡。(三)PDIA6参与非小细胞肺癌细胞凋亡和细胞自噬的分子机制研究1.PDIA6通过JNK/c-Jun信号通路抑制NSCLC细胞凋亡和细胞自噬。2.PDIA6通过MAP4K1抑制JNK/c-Jun细胞信号通路。