目的:间充质干细胞具有高度的自我更新能力、多向分化潜能和免疫调节功能。这些优势使它们成为极具吸引力的研究和临床应用工具。间充质干细胞在治疗骨相关疾病中具有非常重要的意义,此外,间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在多种因子和细胞内信号的转录调控下,可分化为多种细胞类型,包括脂肪细胞和成骨细胞。但其在成骨分化中的具体机制还不完全清楚。钙离子电压门控?3亚基(Calcium Voltage-Gated Channel Auxiliary Subunit Beta 3,Cacnb3)作为电压门控通道的一个亚基,与钙离子调控相关,骨骼的形成离不开钙离子的参与。Cacnb3对间充质干细胞的成骨分化研究尚未见报道,因此探讨Cacnb3在间充质干细胞成骨分化中的作用具有重要意义,本研究主要关注了Cacnb3如何影响细胞的成骨分化及其作用机制。方法:(1)从GEO数据库中下载去乙酰化酶抑制剂(HDACi)处理小鼠前体成骨细胞(MC3T3-E1 preosteoblasts)的生物芯片,利用生物信息技术分析该生物芯片,与成骨基因数据集做合集分析,筛选成骨相关基因。(2)通过胶原酶消化法从小鼠脂肪中分离间充质干细胞,进行体外培养,流式细胞仪检测细胞表面标记物。(3)体外培养小鼠脂肪间充质干细胞ADSCs,成骨诱导培养基为实验组,正常培养基为对照组。培养到第14和21天进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及茜素红染色,以检测小鼠ADSCs是否具有多向分化潜能和间充质干细胞所具有的干性特征。(4)对小鼠脂肪间充质干细胞ADSCs进行成骨诱导并进行定量分析,检测成骨相关基因和筛选基因的表达。在小鼠成骨前体细胞(MC3T3-E1 preosteoblasts)和人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)进行相同的实验验证基因表达的一致性。并在小鼠成骨前体细胞中成骨诱导14天进行相同的碱性磷酸酶和茜素红染色分析,以验证成骨诱导是否成功。(5)利用siRNA敲低Cacnb3在MC3T3-E1中的表达,检测敲低Cacnb3后对成骨相关基因表达的影响。同时,利用钙离子荧光探针Fluo-4 AM检测敲低Cacnb3对细胞内钙离子浓度水平的影响。结果:(1)利用生物信息技术分析表达谱数据筛选出22个基因,这些基因在成骨分化中表达上调,在脂肪分化中表达下调,且受去乙酰化酶抑制剂的严格调控。通过功能分析,发现有6个基因(Cacnb3、Lpcat2等)与钙离子调控相关。(2)利用酶消化法成功培养出小鼠脂肪间充质干细胞,传代稳定,增殖能力强,利用流式细胞仪检测证实有特定的间充质干细胞表面标记物表达(CD45、CD44、CD29、Sca-1),表明我们所分离培养的小鼠脂肪间充质纯度较高,可用于后续实验。(3)小鼠ADSCs成骨诱导14天和21天后,碱性磷酸酶染色和茜素红染色可看出我们所分离的小鼠ADSCs具有成骨分化潜能和干细胞特有的干性。(4)小鼠ADSCs经成骨诱导后成骨相关基因(Runx2、Alp、Col1a1、Opn)和筛选出来的基因Cacnb3和Lpcat2的表达量在实验组中明显高于对照组(P<0.05),进一步验证,发现在MC3T3-E1细胞系和人的骨髓间充质干细胞成骨诱导中具有相似的结果。(5)与siRNA-NC组细胞相比,siCacnb3细胞中Cacnb3基因的mRNA表达下调,且mRNA表达水平在敲低效率70%(P<0.001),成骨相关基因(ALP、Runx2)在沉默第5天后siCacnb3组较siRNA-NC组mRNA表达均下降。此外,敲低Cacnb3后钙离子浓度明显低于siRNA-NC组。结论:Cacnb3在细胞的成骨分化过程中表达上调,表明Cacnb3基因在细胞的成骨分化中可能具有促进作用,敲低Cacnb3会影响细胞内钙离子水平,表明Cacnb3可能是通过钙离子通路调控细胞的成骨分化,本研究为进一步探索间充质干细胞的成骨分化机制奠定了基础。