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肠出血性大肠杆菌O157:H7是一种可引起人或牲畜肠出血性腹泻等疾病的细菌性病原体,是典型的食源性致病菌。牛是该病原细菌在自然界中最主要的携带者之一,通常可无症状携带,人与家禽也是该细菌病原体的携带者。此病原细菌的主要传播方式为粪口途径,传播媒介十分广泛,包括受污染的水源、土壤、肉、蛋、奶等。肠出血性大肠杆菌O157:H7感染力强,感染剂量低,目前在全世界大部分地区都有爆发流行与散发病例的报道,引起人们的广泛关注。传统细菌检测方法存在检测时间长,检测灵敏度低,实验操作步骤繁琐等缺点,不适用于现场快速检测。核酸适配体,是指通过SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment)技术在体外筛选的,对靶分子具有高亲和力、高特异性的单链DNA或RNA。其具有靶标物质范围广泛,筛选周期短,亲和力高,特异性好,易保存运输等诸多优点,被人们视为抗体的替代品。表面增强拉曼光谱技术,是指通过使用特殊的表面增强吸附分子,大大增强待检测生物样品拉曼信号强度的现象,目前该技术已被广泛应用于细菌检测领域。本课题研究内容如下:(1)肠出血性大肠杆菌O157:H7特异性核酸适配体的筛选与评价。以肠出血性大肠杆菌O157:H7为靶标物质,将其与随机寡核苷酸库共同孵育,分离未结合的ssDNA,富集结合的ssDNA,通过十五轮筛选过程,获得高亲和力、高特异性的核酸适配体库。通过高通量测序与二级结构分析得到候选适配体序列。通过ELISA技术分析候选适配体亲和力与特异性,得到与靶标物质具有高亲和力、高特异性的核酸适配体。(2)基于核酸适配体表面增强拉曼光谱技术快速检测肠出血性大肠杆菌O157:H7方法的建立。将肠出血性大肠杆菌O157:H7与经过折叠处理的特异性核酸适配体共同孵育,通过洗涤分离未结合与结合力低的适配体。通过原位还原纳米银的方法,在肠出血性大肠杆菌O157:H7与特异性核酸适配体结合的复合物表面原位还原纳米银壳。通过拉曼光谱仪采集复合物表面的拉曼光谱信号。本研究采用whole-bacteria-SELEX技术,获得肠出血性大肠杆菌O157:H7高亲和力、高特异性单链DNA适配体,为建立肠出血性大肠杆菌O157:H7检测方法奠定基础。又基于核酸适配体表面增强拉曼光谱技术,成功建立一种检测时间短、操作步骤简单、检测准确率高、检测特异性好的肠出血性大肠杆菌O157:H7检测方法,该检测方法重复性良好,最低检测限为10~2 cfu/mL,为肠出血性大肠杆菌O157:H7现场快速检测奠定基础,具有一定的发展前景。