背景和目的肿瘤组织是异质性的,包括许多不同的细胞亚群,这些亚群细胞在细胞表型,功能和基因表达等方面存在差异。肿瘤干细胞假说认为:同正常的组织和器官一样,肿瘤组织也包含一小群具有干细胞特性的肿瘤细胞,他们的存在是肿瘤得以存活的必须条件,同占肿瘤绝大多数的“已分化”肿瘤细胞相比,肿瘤干细胞在肿瘤发生和发展过程中扮演着更为重要的角色。肿瘤干细胞首先在血液系统肿瘤中被报道。最近几年随着研究的深入,通过基于独特干细胞标志的表达检测的流式分选和免疫磁珠分选技术,科研工作者又陆续从不同类型的实体瘤中成功的分离出相应的肿瘤干细胞。这些肿瘤干细胞是肿瘤组织内具有无限的增殖能力和很强致瘤能力的细胞,他们的含量往往非常稀少。例如,Ricci-Vitiani和他的同事证明,结肠癌来源于一小群未分化的CD133+细胞,这些细胞只占整个肿瘤组织细胞的2.5%却能在无血清培养基中以未分化细胞球的形态对数生长超过一年的时间,并保持致瘤性。如果肿瘤干细胞是肿瘤的“干”,那么对肿瘤干细胞的深入研究,将有可能从全新的角度去阐明肿瘤发生、发展的机制,从而为肿瘤的诊断、治疗提供一种新的思路,具有无限的发展空间和深远的科学意义。有效的分离肿瘤干细胞是肿瘤干细胞研究的基础。基于干细胞表面标志的分离是目前主要运用的分离手段之一。CD133是目前为止唯一公认的肿瘤干细胞表面标志。CD133是一种相对分子质量为117kDa,位于细胞膜表面具有5个跨膜区的膜蛋白,曾命名为AC133。CD133最先在造血干或祖细胞中发现,后续的研究发现CD133也是非造血系统干细胞的标志,在内皮前体细胞和神经前体细胞中常有表达,而成熟血细胞、内皮细胞及神经细胞则没有表达。最近的研究发现:在许多实体瘤中同样存在CD133+细胞,这些细胞具有肿瘤干细胞的特性,因此,CD133也可作为结肠癌干细胞的标志。目前肿瘤干细胞的研究主要集中在从原代肿瘤组织中分离干细胞,许多文献也证明,肿瘤干细胞的确存在于原代肿瘤组织中。是否存在其他的替代细胞来源呢?已经建立的肿瘤细胞系可能是肿瘤干细胞研究的较好的替代细胞来源。同原代细胞分离相比,细胞系分离有许多优点,例如,基因背景清楚,稳定的细胞表型和生物学特性和没有其他细胞污染等。建系的过程可能就是对肿瘤干细胞的筛选过程,大多数从原代标本上消化下来的细胞仅仅能分裂有限的次数,最终,只有非常少的细胞能存活形成细胞系。这些经过压力筛选后建立的肿瘤细胞系具有同干细胞相似的无限增殖,分化,自我更新和成瘤能力,因此,我们有理由相信肿瘤细胞系可能来源于肿瘤内的肿瘤干细胞。肿瘤干细胞可能是肿瘤治疗失败的重要原因,Todaro等的研究表明结肠癌肿瘤干细胞通过产生Interleukin-4(IL-4)促进肿瘤细胞生长和抵抗细胞死亡。Dean认为,表达ABC转运载体的肿瘤干细胞是引起的肿瘤药物耐药的重要因素。因此,对肿瘤干细胞特性的研究将进一步的阐明肿瘤耐药机制,从而促进肿瘤治疗的进展。本研究拟通过对结肠癌细胞系进行肿瘤干细胞特性的评估,试寻找适合用于结肠癌干细胞分选的细胞系,并在此基础上对其特性进行进一步研究。另外,本研究还将探讨肿瘤干细胞分离的有效方法,并初步检测干细胞耐药蛋白的表达,以期为后续干细胞功能研究打下基础。方法1、利用流式细胞术,RT-PCR检测8种结肠癌细胞中CD133的表达情况;利用条件培养观察8种细胞系的肿瘤细胞在无血清培养基中的生物学特性;利用裸鼠成瘤模型检测成瘤能力和转移能力。2、利用流式细胞术,RT-PCR和Western印记法检测HCT116细胞系CD133和CD44的表达情况;利用克隆形成试验检测HCT116细胞的自我更新能力;利用含血清培养基诱导分化无血清培养形成的细胞球并利用免疫组化检测分化标志CK20的表达情况;利用NOD-SCID小鼠成瘤模型检测HCT116细胞的最小成瘤细胞数。3、利用免疫磁珠分选技术分离CD133+细胞和CD133-细胞,无血清培养分选后的两种细胞观察他们生物学特性;结果1、CD133在8种细胞系中的表达有显著差异,最高的HCT116细胞系中CD133+细胞含量为91.4±5.0%;各种细胞系细胞均能在无血清培养基中增殖,HCT116细胞能形成“神经球样结构”且具有较高的致瘤能力和转移能力。2、41.47±1.28%的HCT116细胞能在无血清培养基中形成典型的“神经球”样结构;5000个细胞就能在NOD-SCID小鼠中形成皮下移植瘤;大多数的HCT116细胞都是CD133+CD44+细胞;“神经球”样结构在含血清培养基中分化,表达分化标志CK20。3、分选后获得的阳性细胞群的阳性细胞含量为94.71±2.65%,阴性细胞群的阴性细胞含量为88.67±3.12%;CD133+细胞能在无血清培养基中连续传代形成球样结构,CD133-细胞却不能。结论1、相对于其他7种细胞系,HCT116细胞系具有更强的体外自我更新能力,致瘤能力及转移能力,更适合于结肠癌干细胞的研究。2、大多数的HCT116细胞具有肿瘤干细胞特性,因此HCT116细胞系可能是一个结肠癌干细胞系。3、免疫磁珠能有效的分离CD133+细胞和CD133-细胞,体外培养的CD133+结肠癌干细胞具有和普通干细胞类似的无限增殖、自我更新和分化能力。