论文部分内容阅读
研究背景从1977年世界上第1例经皮冠状动脉腔内血管成形术开始,血管内治疗有了新的突破。随着血管介入学的发展,金属裸支架(BMS)及药物涂层支架(DES)的出现,血管内介入治疗达到了新的里程碑,但是金属支架长期滞留在血管内会出现血管壁损伤、慢性炎症反应、支架内血栓的生成及血管内膜增生,最终导致血管内再狭窄的发生。涂布抗增殖药物的药物洗脱支架虽然能很好地抑制血管内膜增生,有效的减少血管内再狭窄的发生率,但仍会导致亚急性或者晚期血栓的形成,故需要12个月甚至更长时间的双联抗血小板治疗,随后生物可降解支架的出现成为必然。生物可降解支架依据其主要成分可以分为生物聚合物可吸收支架(BPVS)和生物金属可降解支架(BMAS)。BPVS由于径向支撑力不足导致降解后期诱发血管内血栓形成,为了增强径向支撑力BPVS使用可较厚的支架骨骼,从而导致支架断裂。BMAS作为新型可降解支架具有良好的径向支撑力和降解特性。在多种材料中,镁合金可降解支架(Mg-BMAS)具有优异的降解特性以及生物安全性,并且已经有研究应用于人下肢血管、心肺循环大血管等。多项动物实验也验证了镁合金可降解支架在脑血管中的应用具有一定的安全性和有效性。在脑血管动脉瘤相关研究中发现镁合金支架凭借其可降解的特性在辅助动脉瘤栓塞后能自行降解,大大降低了载瘤动脉的炎症反应,促进动脉瘤的愈合。在缺血性脑血管疾病中,可降解支架的植入有助于脑血流的灌注,在血管内皮修复完成后逐渐降解直至消失,避免了术后长期抗血小板的辅助治疗,减小术后并发症发生的可能性。随着研究的深入,镁基合金支架的降解速率过快的缺点逐渐暴露,在血管功能恢复完成前镁支架就已失去径向支撑力,成为镁合金可降解支架术后预期不佳的主要原因。血管内皮生长因子(VEGF)作为最具活性的血管活性因子,具有促进内皮化的作用。有研究使用VEGF基因转染人脐静脉细胞发现,VEGF的过表达能促进细胞的增殖、迁移和内皮细胞管样形成。VEGF的下调则会抑制内皮细胞的反应。本研究假设镁合金可降解支架上涂布人VEGF重组基因能转染到内细胞,进而促进内皮细胞的增殖,加速支架植入处血管的内皮化,从而解决镁合金可降解支架降解速度过快等问题。研究目的1.构建人VEGF重组质粒涂布镁合金可降解支架,通过体外细胞实验研究人VEGF重组质粒涂布镁合金可降解支架对内皮细胞的增殖、粘附和管样生成的影响。2.构建人VEGF重组质粒涂布镁合金可降解支架,通过动物活体实验研究人VEGF重组质粒涂布镁合金支架植入血管后支架降解速率和血管直径影响。研究方法1.构建人VEGF重组质粒涂布镁合金可降解支架后,将支架分为三组:A组:裸镁支架组(Con)、B组:脂质体+镁支架组(Lipo)、C组:VEGF+脂质体+镁支架组(Lipo+VEGF)。分别将其植入人脐静脉内皮细胞(HUVECs)内培养后提取培养液,通过Western blot提取分析相关蛋白表达、内皮细胞增殖实验、内皮细胞黏附实验和内皮细胞成管实验研究涂布镁合金可降解支架对内皮细胞的影响。2.在兔单侧颈总动脉处植入涂布镁合金可降解支架,将兔子分为三组:对照组:Mg支架组(Con)、实验组:Mg支架+PLLA+脂质体组+人VEGF组(VEGF)。植入支架1、2和4周后随访,收集血管相关影像资料。通过影像资料分析血管管腔的结构及性质的改变。研究结果1.Western blot分析人脐静脉内皮细胞表达的VEGF-A和VEGFR-1,2。VEGF-A在C组(Lipo+VEGF)表达较A组(Con)及B组(Lipo)高;C组内皮细胞表面的VEGFR-1表达高于其他组并远高于VEGFR-2,说明人VEGF重组质粒能促进VEGF的表达,易于与VEGFR-1结合。2.孵育不同涂层支架的培养液在人脐静脉内皮细胞中的效果也不同,从而导致在内皮细胞增殖、成管及粘附实验有显著差异。C组(Lipo+VEGF)相比于其他组能更好的促进内皮细胞的增殖、成管及粘附。3.在动物实验中,镁合金可降解支架植入术术后即刻支架段血管管径均增加。支架段在对照组中发现1周随访和2周随访出现血管再狭窄的情况;实验组1周组和4周组出现严重的血管内狭窄;结合IVUS分析支架的降解程度发现实验组1周随访和4周随访组降解速度过快是血管内狭窄的主要原因。研究结论外源性人VEGF重组质粒促进内皮细胞表达的VEGF具有和内源性VEGF一样能促进内皮细胞的增殖、粘附和血管新生的作用,主要机制是促进了 VEGFA与VEGFR-1结合。体外实验还发现左旋多聚赖氨酸和脂质体作为质粒涂布支架的载体并不会影响VEGF的表达和细胞的破坏,所以人VEGF重组质粒涂层是安全有效的。在体内试验中,在早期裸MgZnYNd支架虽有降解,但同时能给血管提供有效的径向支撑力;通过理论分析,MgZnYNd支架涂布VEGF重组质粒能很好的加速支架置入生物血管后内皮的修复;涂布过程中支架的氧化、良好的支架压握程度是本研究仍需探索的方面。