1研究背景AS是一种有基因突变、环境刺激、代谢异常等多种因素相互作用的多因素疾病。AS的病因以及机制复杂不明,目前研究显示吸烟、高龄、高血压、男性性别、高胆固醇血症和糖尿病是导致AS的主要危险因素。临床上急性冠状动脉综合征如果合并糖尿病30天和1年的死亡率显著高于无糖尿病患者。糖尿病与心血管事件远远不是血糖水平高低的点对点的因果关系,糖尿病有我们未发现的独立于血糖升高之外的机制促进动脉粥样硬化。AMPK是细胞能量代谢的感受器。研究发现敲除小鼠编码AMPKa2的基因,血管内皮细胞出现明显的炎症反应,表现为IkBa蛋白水平下降、NF-κB活化、NADPH氧化酶的蛋白表达上调以及大量活性氧(Reactive oxygen species, ROS)的产生。有关AMPK在AS中的作用,近期发现二甲双胍或降脂药他汀类等均能激活AMPK,产生内皮保护作用及抗AS作用。二甲双胍是目前临床广泛应用的口服降糖药。既往也有研究发现AMPKa2活化后可以直接进入细胞核并磷酸化AP-2a第219丝氨酸残基,上调其转录活性,最终参与了吸烟所诱导的腹主动脉瘤(AAA)形成。转录因子活化蛋白2a (Activator Protein, AP-2a)是一种转录因子,属于AP-2家族,包括α、β、γ、δ和￡等5个成员,一种典型的结合序列为GCCXXXGGC.而我们分析IkBα的基因启动子上含有AP-2α的作用结构域。综上所述,我们提出科学假说：二甲双胍通过激活AMPK,通过上调AP-2α/IkBα通路,抗动脉粥样硬化斑块形成以及稳定斑块的作用。2研究目的(1)AMPK激活后是否通过AP-2α上调IkBa的基因表达；(2)二甲双胍是否通过激活AP-2a/IkBa抗AS。3研究方法3.1凝胶迁移或电泳迁移率检测(Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMS A)将IκBα基因启动子(200和1400bp)的DNA与AP-2α重组蛋白在反应缓冲液中温育。分离混合物,SYBR Green检测DNA与SYPRO Ruby检测蛋白从而检测AP-2α和NF-κB的相互作用。3.2染色质免疫沉淀技术(ChIP)收集细胞蛋白,用ChIP测定AP-2α与IκBα基因启动子的结合能力。3.3细胞培养(1)小鼠平滑肌细胞应用1mMAICAR刺激细胞24h。收集细胞提取蛋白检测AMPK、AP-2α、IκBα的蛋白表达。(2)小鼠平滑肌细胞转染Control shRNA和AP-2a shRNA干扰AP-2a的表达后,1mM AICAR刺激细胞24h,收集细胞检测IκBα的表达。(3)小鼠平滑肌细胞转染Control shRNA和AP-2a shRNA后,50ng/μL的TNF和1mM AICAR刺激24小时,DHE测定活体细胞ROS的水平。3.4构建AP-2aα慢病毒载体构建三个不同序列的干扰AP-2a的慢病毒载体。转染MOVAS细胞证实转录因子AP-2α干扰效果,筛选干扰效果最优序列。3.5动物模型的建立(1)雄性ApoE-/-小鼠均购买周龄为8-10周的,给予普食喂养1周后慢病毒尾静脉注射。根据转染病毒的不同以及是否给予二甲双胍干预,将ApoE-/-小鼠随机分为4组：(1)Control shRNA组；(2) Control shRNA给予二甲双胍药物干预组；(3)AP-2a shRNA组；(4)AP-2a shRNA给予二甲双胍药物干预组组。4周后,给予300mg/kg/天的二甲双胍。所有小鼠全程高脂饮食,8周后实验结束,ApoE-/-小鼠被处以安乐死。(2)雄性ApoE-/-小鼠均购买周龄为8-10周的,给予普食喂养1周后给予颈总动脉套管手术并给予慢病毒尾静脉注射。根据转染病毒的不同以及是否给予二甲双胍干预,将ApoE-／-小鼠随机分为4组,(1) Control shRNA组；(2)Control shRNA给予二甲双胍药物干预组;(3) AP-2ashRNA组；(4)AP-2ashRNA给予二甲双胍药物干预组。4周后,给予300mg/kg/天的二甲双胍饮水,并再次给与尾静脉病毒注射。所有小鼠全程高脂饮食,结束实验后,小鼠处安乐死取材进行后续实验。3.6代谢指标的测定试验结束后,小鼠均麻醉后进行体重测量。小鼠被麻醉后后行心脏左心室穿刺采血,检测血清中代谢相关指标。3.7组织病理学测定分别制备主动脉根部和颈动脉斑块组织的冰冻切片,HE染色测定斑块负荷,a-SMA和MOMA-2分别测定平滑肌细胞和巨噬细胞含量,天狼猩红染色和油红O染色分别测定胶原含量和脂质含量,测定易损指数。免疫组化染色测定斑块组织内AP-2α; 4-HNE; 3-NT; Nox4; p47;IKBα。3.8 Western blot取出冻存与-80℃冰箱中主动脉根部及右侧颈动脉组织,提取蛋白,检测AP-2α的表达。4 结果4.1 AP-2α能够与IκBα的启动子特异结合EMSA测定发现AP-2α重组蛋白能够与IkBa的DNA体外相互作用。ChIP测定发现在细胞内AP-2α蛋白能够和IkBa的基因启动子相互结合。4.2 AMPK活化增加了AP-2α与IκBα的表达Westernblot结果显示AICAR激活AMPK后,增加了磷酸化AP-2α和IκBα的表达。4.3 激活AMPK后,需要通过AP-2α上调IκBα的蛋白表达AP-2a shRNA干扰AP-2α后,激活AMPK不能明显增加IκBα的蛋白表达。4.4 激活AMPK后,需要通过AP-2α抑制细胞内氧化应激反应DHE测定活细胞内ROS的表达,AP-2a shRNA干扰AP-2α后,激活AMPK并不能抑制细胞内ROS的含量。4.5 ApoE-/-小鼠代谢相关指标的检测体重和血脂检测结果显示,ApoE-/-小鼠各组无显著差异。4.6 慢病毒在主动脉根部斑块组织中干扰效率主动脉根部斑块组织内可见明显GFP绿色荧光。免疫组化以及Westernblot测定主动脉根部组织中AP-2α的蛋白表达量,慢病毒可以有效的干扰AP-2α的表达。4.7 慢病毒在颈动脉斑块组织中的干扰效率颈动脉易损斑块模型的实验中,病毒转染2周后,GFP在颈动脉斑块组织内的表达含量明显增加。Westernblot以及免疫组化结果显示,慢病毒转染明显的减少了斑块组织中AP-2α的蛋白表达。4.8 二甲双胍通过激活AP-2α增加IK-Bα的表达免疫组化的结果显示二甲双胍需要通过激活AP-2α增加IK-Bα的表达,慢病毒干扰减少了AP-2α表达后,二甲双胍不能明显增加IK-Bα在斑块组织中的表达。4.9 二甲双胍通过激活AP-2α抑制颈动脉斑块组织内氧化应激与Control shRNA组比较,二甲双胍不能明显减少AP-2a shRNA组颈动脉斑块组织中氧化应激指标的表达。4.10 二甲双胍抗动脉粥样硬化作用需要通过激活AP-2α与Control shRNA组比较,慢病毒干扰了AP-2α后,二甲双胍药物干预不能明显抑制动脉粥样硬化斑块发生发展；同样慢病毒干扰了AP-2α后,二甲双胍干预不能明显降低颈动脉斑块的易损指数。5 结论(1)AP-2α是IkBa的基因转录因子。(2)二甲双胍通过激活AP-2a/IkBa抗炎和抗动脉粥样硬化。1研究背景转录因子活化蛋白2α (Activator Protein, AP-2α)是一种转录因子,属于AP-2家族,包括α、β、γ、δ和ε等5个成员。研究发现敲除AP-2基因导致了小鼠神经系统及心血管系统发育缺陷,在胚胎期或出生后立即死亡,显示AP-2具有重要的生物学功能。有文章报道,AMPKα2活化后直接进入细胞核并磷酸化AP-2α第219丝氨酸残基,上调其转录活性,最终参与了吸烟所诱导的腹主动脉瘤(AAA)形成。阿司匹林通过抑制COX从而抑制循环中的血小板,因此在动脉粥样硬化性疾病的治疗中具有重要作用。然而,阿司匹林最初用于临床是一种抗炎药物。在动脉粥样硬化过程中,阿司匹林不仅可以抑制血小板,抑制血栓形成,还可抑制NF-κB和COX-2抑制氧化应激抑制抗炎反应。近年来,有关于阿司匹林抗动脉粥样硬化作用机制的研究不断出现,阿司匹林已成为成为临床上冠心病预防及治疗不可或缺的药物。既往研究发现阿司匹林激活血管细胞AMP活化蛋白激酶(AMPK),并且在血管平滑肌细胞(VSMC)中激活AMPK增加AP-2a磷酸化。综上所述,我们提出如下假说：阿司匹林通过AP-2a的磷酸化上调IκB-α的表达从而抗动脉粥样硬化斑块形成以及促进斑块稳定的作用。2研究目的(1)阿司匹林是否激活AP-2a而上调IκBα的基因表达。(2)阿司匹林是否通过激活AP-2a上调IκBα的基因表达抗动脉粥样硬化斑块形成以及促进斑块稳定。3实验方法3.1 AP-2a慢病毒载体的构建同论文I。3.2建立相应的动物模型(1)给予8周龄雄性ApoE-/-小鼠普通饮食喂养,持续1周时间适应环境,给予颈总动脉套管手术,硅胶管的规格为0.30mm的内径,0.50mm的外径,长度是2.5mm,并给予全程高脂饮食,在高脂喂养4周后,随机分为4组：无阿司匹林(n=20)：实验全程小鼠饮水中无阿司匹林。小剂量阿司匹林组(n=20)：阿司匹林5 mg/kg/day予小鼠所饮之水中。中等剂量阿司匹林组(n=20)：阿司匹林20 mg/kg/day子小鼠所饮之水中。大剂量阿司匹林组(n=20)：阿司匹林50 mg/kg/day予小鼠所饮之水中。8周之后,实验结束,留取血液和组织标本。(2)8周龄雄性ApoE-/-小鼠普食喂养1周后就给予慢病毒尾静脉注射。根据转染病毒的不同以及是否给予阿司匹林干预,将ApoE-/-小鼠随机分为4组：(1)Control shRNA组(2)Control shRNA并给予阿司匹林组(3) AP-2ashRNA组(4)AP-2ashRNA并给予阿司匹林组。4周后,给予50mg/kg/天的阿司匹林并再次给予病毒注射。所有小鼠全程高脂饮食。(3)8周龄雄性ApoE-/-小鼠普食喂养1周后,给予颈总动脉套管手术硅胶管的规格为0.30mm的内径,0.50mm的外径,长度是2.5mm,并给予慢病毒尾静脉注射。根据转染病毒的不同以及是否给予阿司匹林干预,将ApoE-/-小鼠随机分为4组,4周后,给予50 mg/kg/天的阿司匹林并再次给与尾静脉病毒注射。所有小鼠全程高脂饮食。3.3体重和血脂测定ApoE-/-小鼠均在实验末行体重测量以及血脂指标的检测。3.4组织病理学检测HE染色观察斑块负荷,天狼猩红染色检测胶原含量,油红0染色检测脂质含量,MOMA-2和a-SMA免疫组化染色,统计分析后计算易损指数。斑块组织AP-2a; 4-HNE; Nox4; p47;IκBα的表达应用免疫组化检测。3.5细胞培养(1)平滑肌细胞应用0、25、50、100、200、400μg/ml的阿司匹林,分别刺激细胞24h。收集细胞以提取蛋白检测AP-2a表达水平。(2)平滑肌细胞应用10μg/mlTNF-a的和200μg/ml的阿司匹林刺激24小时,收集细胞测定AP-2a的转录活性以及IkBa的表达量。(3)根据转染病毒的不同,将细胞分为6组：转染vector无阿司匹林干预；转染vector并给与阿司匹林；转染WT-AP-2a无阿司匹林干预组；转染WT-AP-2a并给与阿司匹林组；转染S219A-AP-2a无阿司匹林干预组；转染S219A-AP-2a并给与阿司匹林组。200 μg/ml的阿司匹林刺激24小时,收集细胞。3.6 Western blot提取蛋白,检测颈动脉组织以及平滑肌细胞IκBα、AP-2α、磷酸化AP-2a的表达。3.7 Electrophoretic Mobility Shift Assay(EMSA)收集颈总动脉斑块组织和细胞,提取核蛋白,检测AP-2a和NF-κB的转录活性。3.8实时定量PCR提取mRNA,检测IκBα的mRNA水平。3.9染色质免疫沉淀技术(ChIP)提取细胞蛋白,测定阿司匹林刺激平滑肌细胞24小时后AP-2α与IκBα的结合情况。3.10血中和尿中F2-isoprostanes的测定小鼠血中和尿中F2-isoprostanes活性的测定应用LC-MS/MS。3.11收集临床患者的外周血标本收取临床患者的外周全血,提取单核细胞提取蛋白westernblot测定磷酸化AP-2a与IκBα的表达4 结果4.1 ApoE-/-小鼠体重及血脂的检测实验结束后各组小鼠体重和血脂指标无显著差异。4.2不同剂量阿司匹林对小鼠胃肠道无明显的毒性作用我们对不同剂量阿司匹林喂养后的ApoE-/-小鼠的胃进行大体形态以及组织切片后,HE染色组织学分析表明,胃粘膜的形态是正常的,没有发现明显的胃粘膜以及组织损伤。4.3慢病毒在主动脉根部组织中转染效率以及对AP-2a的干扰在慢病毒转染第2周末,主动脉根部斑块组织内可见明显GFP绿色荧光。测定主动脉组织中AP-2a的蛋白表达量,慢病毒可以有效的干扰AP-2α的表达。4.4慢病毒在颈动脉斑块组织中的转染效率以及对AP-2a的干扰在斑块易损性模型中,在病毒转染后2周,GFP在颈动脉斑块组织内的表达量明显增加。测定颈动脉组织中AP-2a的蛋白表达,慢病毒明显干扰了颈动脉斑块组织中AP-2a的表达。4.5在高脂饮食的ApoE-/-小鼠中,不同剂量的阿司匹林对动脉粥样硬化的发生和发展的作用5mg/kg/天阿司匹林没有明显降低动脉粥样硬化斑块的负荷。20和50mg/kg/天阿司匹林显著抑制了整体主动脉以及主动脉根部动脉粥样硬化斑块的大小。4.6不同剂量阿司匹林对高脂饮食ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块稳定性的影响20和50mg/kg/天的阿司匹林明显增加了斑块的稳定性。而5mg/kg/天的阿司匹林与对照组相比,没有明显改善斑块的稳定性。20和50mg/kg/天的阿司匹林均明显的减少了斑块的易损指数并且50 mg/kg/day的阿司匹林较20mg/kg/day更加明显。4.7阿司匹林对高脂饮食的ApoE-/-小鼠颈动脉斑块组织中磷酸化AP-2a的表达的影响与无阿司匹林相比,20-50mg/kg/天的阿司匹林明显增加了颈动脉斑块中磷酸化的AP-2a的表达量,而5mg/kg/天的阿司匹林对磷酸化的AP-2a的表达影响不明显。4.8慢病毒介导的AP-2a干扰对阿司匹林的抗动脉粥样硬化机制的影响慢病毒干扰了AP-2a后,阿司匹林没有明显抑制主动脉的斑块负荷；同样慢病毒干扰了AP-2a后,阿司匹林并没有明显降低动脉粥样硬化斑块的易损指数。4.9阿司匹林抗动脉粥样硬化的机制研究4.9.1阿司匹林对平滑肌细胞中AP-2a的表达以及转录活性的影响分别用0,25,50,100,200,400μg/ml的阿司匹林刺激人主动脉平滑肌细胞24小时后测定磷酸化的AP-2a的表达量。结果显示阿司匹林刺激可以明显增加磷酸化AP-2a的表达。通过EMSA实验发现阿司匹林刺激明显增加了AP-2a的转录活性。4.9.2阿司匹林对平滑肌细胞中IkBa表达的影响应用TNFa(10ng/ml)与阿司匹林(200 ng/ml)同时刺激平滑肌细胞24小时,PCR以及Westernblot测定IkBa的表达,结果显示阿司匹林可以明显增加IkBa的表达并且改善了]NFa刺激引起的IkBa的表达的减少。4.9.3阿司匹林通过激活AP-2a增加IKBa的表达以及抑制氧化应激用对照病毒、AP-2α野生型病毒(WT)和AP-2α突变的病毒转染细胞48小时后,再应用阿司匹林(200μg/ml)刺激平滑肌细胞24小时,Westernblot测定AP-2a和IkBa的表达,结果显示干扰AP-2a的表达后阿司匹林不能明显增加IkBa的表达。同样当应用对照病毒、AP-2a野生型病毒(WT)和AP-2a突变的病毒转染细胞48小时后,再应用阿司匹林(200 μg/ml)刺激平滑肌细胞24小时,DHE测定细胞内ROS的表达,结果显示干扰AP-2a的表达后阿司匹林不能明显抑制细胞内ROS的表达。4.10阿司匹林对高脂饮食的APOE-/-小鼠氧化应激的影响与Control shRNA相比AP-2a shRNA;慢病毒干扰AP-2a后,阿司匹林不能明显抑制颈动脉斑块组织中p47(B), Nox4(C),4-HNE(D)的表达。同样与Control shRNA相比AP-2a shRNA慢病毒干扰AP-2a后,阿司匹林不能明显减少小鼠血液和尿液中F2-isoprostanes生物活性。4.11阿司匹林激活冠心病患者AP-2a及IkBa的表达收集临床上服用阿司匹林100 mg/天持续2-6个月的冠心病患者以及未服用阿司匹林的冠心病患者的外周血,提取单核细胞。与未服用阿司匹林的冠心病患者相比,服用阿司匹林患者外周血单核细胞中的磷酸化AP-2a和IkBa的蛋白表达量明显增加。我们收集同一个个体服用阿司匹林前,以及服用阿司匹林100mg/天持续4周后外周血,阿司匹林明显增加外周血单核细胞中磷酸化AP-2a和IkBa的蛋白表达。5结论(1)阿司匹林激活AP-2a从而上调IkBa的基因表达。(2)在高脂饮食ApoE-/-小鼠模型中,阿司匹林激活AP-2α上调IkBα的基因表达从而抑制动脉粥样硬化斑块的发生发展,增加了斑块稳定性。