杨树NPR1基因的克隆及功能验证

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杨树作为林业生产中的模式植物,因其生长速度快、适应性强和丰产等特性在世界各地广泛种植。然而,杨树病害多样,传统的抗病措施存在局限性,抗病机制的研究及分子育种具有很大的发展前景。系统获得性抗性(systemic acquiredresistance,SAR)是一种植物主动防御机制,由局部感染引起的天然免疫反应,可保护植物体免受细菌、真菌及病毒的侵染,具有广谱抗病性。NPR1基因是植物SAR信号途径中重要的调节因子,在水杨酸或病原体激发下可诱导PR基因。过量表达NPR1类基因可有效增加植物自身的抗性。本文利用生物信息学的方法,根据杨树基因组数据分析了NPR1基因的特点,在此基础上克隆和确定了南林95杨中的NPR1同源基因,构建其系统进化树,利用多重序列比对分析锚蛋白重复和BTB/POZ构域的分布,同时开展了PtNPR1.1亚细胞定位研究。构建pBI121+PtNPR1.2过量表达载体,对杨树进行遗传转化,并对转化植株进行了抗生素筛选和PCR鉴定。获得了如下主要结果:(1)克隆得到杨树两个NPR1的同源基因PtNPR1.1(JQ231218)和PtNPR1.2(JF732893)。(2)PtNPR1.1和PtNPR1.2相应的蛋白序列和进化关系分析表明其与拟南芥NPR1基因结构及功能上高度的同源性。(3)构建了PtNPR1.1-GFP融合表达载体,转化拟南芥原生质体表明PtNPR1.1的亚细胞定位在细胞质中。(4)PtNPR1.1和PtNPR1.2的组织特异性和诱导表达分析表明杨树NPR1基因没有组织特异性并且受外源SA的诱导。(5)克隆了PtNPR1.1和PtNPR1.2的启动子,并进行分析表明含有与SA信号途径相关的顺式反应元件RAV1AAT和W-boxes。(6)构建表达载体pBI121+PtNPR1.2,采用农杆菌介导的叶盘法对南林95杨进行遗传转化,经抗生素筛选获得2株转基因植株。
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