为建立水牛精原细胞体外培养及分化的培养体系，本研究以本地水牛睾丸为材料，进行了如下研究：　　 (1)探讨了初情期前的水牛曲精细管发育与管中细胞类型变化的关系，以及水牛精原细胞体外检测的方法。结果发现，水牛曲精细管直径在50-62.5μm之间均没有检测到其管中细胞PGP9.5、c—Kit、p19、TP1和PRM2基因的表达；曲精细管直径=75μm时检测到其管中细胞PGP9.5和c—Kit基因的表达，此时出现精原细胞；曲精细管直径=87.5μm时检测到其管中细胞p19基因的表达，此时出现精母细胞；曲精细管直径=10μm时检测到其管中细胞TP1和PRM2基因的表达，此时出现精子细胞；大多数精原细胞呈c—Kit阳性，部分精原细胞呈PGP9.5阳性，精原细胞呈GATA4阴性，支持细胞呈GATA4阳性。以上结果表明，随着水牛睾丸曲精细管的发育，其细胞组合类型发生明显改变，根据曲精细管直径大小来判断初情期前水牛管中各级生精细胞首次出现时间是一个可靠的方法；可以通过c—Kit、PGP9.5、GATA4免疫染色及细胞形态学特征的方法来检测水牛睾丸支持细胞和精原细胞。　　 (2)探讨了水牛精原细胞体外培养及分化的影响因素及其体外发育的潜能。结果发现，培养液中添加2.5％～10％胎牛血清(FBS)能显著提高精原细胞的存活率(P<0.05)；精原细胞培养在34℃和37℃下的存活率之间没有显著差异(P>0.05)；培养液中添加3.3×10-7mol/L维生素A能显著提高培养4d后的精原细胞存活率(P<0.05)，但不能显著提高似精子细胞形成率(P>0.05)；培养液中添加5U/L促卵泡素(FSH)能显著提高培养40d后的似精子细胞形成率(P<0.05)；培养液中添加0.1μmol/L睾酮(T)能显著提高培养41d后的似精子细胞形成率(P<0.05)；精原细胞体外培养4wk后出现8.0～10.0μm的似圆形精子细胞，培养5wk后出现具鞭毛状结构的似精子细胞；似精子细胞注入水牛卵母细胞内形成的重构胚可进一步发育为囊胚；RT—PCR检测到培养后细胞的单倍体精子细胞特异基因PRM2的表达，证实了水牛精原细胞经过长期培养后形成了精子细胞。以上结果表明，在37℃，5％CO2和饱和湿度条件下培养水牛精原细胞，培养液中添加10％FBS、3.3×10-7mol/L维生素A、5U/L FSH和0.1μmol/L T能满足精原细胞体外长期培养的需要，并可以发生增殖与分化最终形成精子细胞。　　 (3)探讨了水牛生精上皮细胞冷冻保存的适宜冷冻保护剂及其浓度。结果发现，当以0％、5％、10％、15％、20％二甲基亚砜(DMSO)添加时，10％DMSO组的细胞解冻后存活率均显著高于其它各组(P<0.05)；当以0％、20％、25％、30％、35％、40％甘油(G)添加时，35％G组的细胞解冻后存活率均显著高于其它各组(P<0.05)；当以0％、5％、10％、15％、20％、25％丙二醇(PG)添加时，15％～25％PG各组的细胞解冻后存活率均显著高于其它各组(P<0.05)，但以20％PG组的细胞存活率为最高；当以0％、5％、10％、15％、20％乙二醇(EG)添加时，5％～20％EG各组的细胞解冻后存活率均显著高于0％EG组(P<0.05)，但以10％EG组的细胞存活率为最高；当分别以5％、10％、15％、20％EG联合10％DMSO添加时，10％EG+10％DMSO组的细胞解冻后存活率为最高，且均显著高于15％EG+10％DMSO组和20％EG+10％DMSO组(P<0.05)；当分别以0.07M、0.14M、0.21M、0.28M、0.35M蔗糖联合10％DMSO添加时，以0.28M蔗糖+10％DMSO组的细胞解冻后存活率为最高，且0.21M蔗糖+10％DMSO组和0.28M蔗糖+10％DMSO组的细胞解冻后存活率均显著高于0.07M蔗糖+10％DMSO组(P<0.05)；而对5种冷冻保护剂各最优浓度组或组合的细胞解冻后存活率比较，10％DMSO、0.28M蔗糖+10％DMSO、35％G组的细胞存活率均显著高于20％PG、10％EG、10％EG+10％DMSO组(P<0.05)，但以35％G组的细胞存活率为最高，达(74.17±1.83)％。以上结果表明，在含10％FBS的DMEM液中添加10％DMSO或35％G作为冷冻液，采用两步慢速冷冻，液氮保存，37℃水浴解冻，是一种具有较高复苏率的冷冻保存水牛生精上皮细胞的方法。　　 (4)利用激光光镊拉曼光谱技术探讨了水牛精子发生过程中生精细胞内分子物质在生物化学上的变化情况。结果发现，成年水牛精子发生中各级生精细胞光谱都具有一些共有或特有的特征峰，部分峰的强度随着生精细胞发育而出现明显加强或减弱的现象，每个峰均代表一种分子物质，其中470和786cm-1峰所对应肝糖和DNA浓度水平在精子发生中均出现了有规律的变化；在细胞差异光谱的比较中，体外培养前后精原细胞与似精子细胞之间的差异光谱和成年水牛精原细胞与精子细胞之间的差异光谱，两者差异光谱的强度和变化趋势最为接近，而和成年水牛其它各级生精细胞之间的差异光谱分别比较，光谱的强度与变化趋势都极不相同，证实了3—5月龄水牛精原细胞经过长期体外培养后分化成了精子细胞。以上结果表明，成年水牛精子发生中各级生精细胞拉曼光谱基本反映了其细胞的主要分子组成及其浓度变化，利用激光光镊拉曼光谱技术并结合细胞形态学特征可以作为鉴定体外分化精子细胞的有效方法之一。