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近几年抗生素的大量使用带来了细菌的耐药性问题日益突出,因此急切需要新的替代品缓解现状。抗菌肽具有稳定性好、对人和畜禽动物安全无毒,不易使病原菌产生耐药性,副作用小等优点,有望成为新一代的抗菌药物研发对象。Drosomycin是黑腹果蝇体内的一类抗真菌肽,对丝状病原真菌具有广谱抗性,其成熟肽由44个氨基酸组成,其中8个Cys形成4对二硫键。这种抗真菌肽在黑腹果蝇体内天然含量极微,提取步骤烦琐、成本高、得率低,不利于工业生产。因此,通过基因工程技术,利用工程菌体外生产Drosomycin成为研究热点。本研究以Drosomycin为研究对象,将其克隆至不同的原核表达载体,转化进大肠杆菌,IPTG诱导后比较Drosomycin的表达情况,选择最优化条件进行抗菌活性检测。主要获得以下研究结果:(1)根据大肠杆菌密码子偏爱性,改造抗真菌肽Drosomycin基因,分别将其克隆至pET-22b、pl188-TF和ppSUMO三个融合表达载体中,转化进E.coli,获得重组表达菌株。(2)IPTG诱导重组菌株中Drosomycin的表达。通过Tricine-SDS-PAGE检测发现利用信号肽Dsb A和pelB能使目的蛋白Drosomycin在大肠杆菌细胞周质中分泌表达。融合表达的TF-Drs蛋白和SUMO-Drs蛋白在细胞质中可溶性表达。(3)将外源表达的融合蛋白TF-Drs和SUMO-Drs通过Ni-NTA进行亲和层析纯化,然后用Factor Xa和SUMO蛋白酶分别酶切,获得相对分子量为4.9kDa的目的蛋白,通过LC-MS鉴定出该蛋白为外源表达的Drosomycin。(4)平板抑菌活性鉴定发现,SUMO融合表达的目的蛋白Drosomycin具有生物学活性,能够抑制粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、稻瘟病病原真菌(Pyricularia oryzac Cavgra)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的生长。同时扫描电子显微镜观察发现,抗真菌肽Drosomycin处理粗糙脉孢菌(N.crassa)和尖孢镰刀菌(F.oxysporum)后,菌丝表面粗糙,凹凸不平,长势不均,证实体外重组表达的Drosomycin能够抑制真菌的生长。(5)通过比较选择最优化表达的重组菌株ppSUMO-Drosomycin/BL21(DE3)进行中试发酵,得到的目的蛋白具有活性且表达产量高,有利于后续的工业生产。(6)利用CCK-8法检测体外重组蛋白Drosomycin对哺乳动物细胞293T和3T3-L1的毒性,结果发现其不影响293T和3T3-L1细胞的增殖,即对哺乳动物细胞无毒性作用。上述研究结果为抗真菌肽Drosomycin的进一步开发利用提供了理论基础。