桑葚籽总黄酮提取工艺优化及生物活性研究

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桑葚为桑科植物桑树的果穗,含有丰富的营养物质,故被列入我国卫生部首批药食两用的水果名录。经研究表明,桑葚进行产品加工后的副产物(桑葚籽)富含油脂、蛋白质、黄酮、二苯乙烯、膳食纤维等活性成分,而有关桑葚籽活性成分的研究主要集中在油脂、蛋白质、膳食纤维等方面,桑葚籽黄酮的提取和生物活性研究仍较为少见。本课题在确定桑葚籽总黄酮含量的基础上,对其不同提取工艺进行了对比研究,旨在获得黄酮得率较高、活性较好的桑葚籽总黄酮提取工艺,并为不同场合中总黄酮提取方式的选择提供参考。最后通过相关试验进一步对比探究了不同提取方式所得桑葚籽总黄酮的抗氧化、抗菌活性,为进一步研究桑葚籽活性成分,提高其综合利用率提供参考依据。本试验主要研究内容如下:
  (1)将桑葚籽清洗、除杂、粉碎研磨后进行脱水、脱脂、脱色处理,室温条件下将脱水脱脂桑葚籽粉末在300W功率下超声波提取50min得桑葚籽总黄酮粗提物,用紫外线照射、还原反应法、三氯化铁反应法对其进行鉴定,根据芦丁标准曲线测定其含量。结果表明,桑葚籽总黄酮提取得率为3.28±0.03mg/g,桑葚籽总黄酮粗提物中黄酮的含量为68.31%±0.35%,桑葚籽原料中总黄酮含量为2.08±0.03mg/g。
  (2)以桑葚籽总黄酮得率为指标,选取料液比、乙醇体积分数、时间、温度这四个因素进行单因素试验,得出各个因素的最优水平。在此基础上采用响应面法优化提取工艺。结果表明,热回流法提取桑葚籽总黄酮最佳工艺参数为:提取时间109min,提取温度83℃,乙醇溶液体积分数52%,料液比1∶19,在此工艺条件下,桑葚籽总黄酮得率为2.38±0.02mg/g,各因素对黄酮得率的影响由大到小顺序为:温度>提取时间>乙醇体积分数>料液比;超声波法提取桑葚籽总黄酮最佳工艺参数为:提取时间43min,提取温度49℃,乙醇溶液体积分数61%,料液比1∶20。在此工艺条件下提取桑葚籽总黄酮得率为3.51±0.03mg/g,各因素对黄酮得率影响由大到小顺序为:超声时间>温度>乙醇体积分数>料液比。综合而言,热回流法的提取设备条件更易满足,乙醇用量更少,超声波法存在噪声污染,但黄酮提取得率更高、更加节约时间和能源。
  (3)通过超氧阴离子自由基清除能力、总还原能力、DPPH自由基清除能力和羟基自由基清除能力这四个指标比较研究两种方法提取桑葚籽总黄酮的体外抗氧化性。结果表明,热回流法提取桑葚籽总黄酮的超氧阴离子自由基清除率最高能达到81.7%±0.21%,总还原能力的OD值最大能达到1.554±0.02,DPPH自由基清除率最高能达到93.54%±0.95%,羟基自由基清除率最高能达到94.84%±0.69%;超声波法提取桑葚籽总黄酮的超氧阴离子自由基清除率最高能达到79.35%±0.21%,总还原能力的OD值最大能达到1.583±0.02,DPPH自由基清除率最高能达到94.95%±1.09%,羟基自由基清除率最高能达到93.57%±0.47%。表明不同提取方法所得桑葚籽总黄酮均具有较强的抗氧化性且活性之间存在一定的差异,其中热回流法提取桑葚籽总黄酮清除超氧阴离子自由基和羟基自由基的能力略优于超声波法提取桑葚籽总黄酮,超声波法提取桑葚籽总黄酮的总还原能力显著优于热回流法提取桑葚籽总黄酮,清除DPPH自由基的能力也略优于热回流法提取桑葚籽总黄酮。
  (4)以沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、阴沟肠杆菌这4种菌为供试菌,通过测定最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)两项指标来比较研究热回流法以及超声波法提取所得桑葚籽总黄酮的体外抗菌活性。结果表明,热回流法提取所得桑葚籽总黄酮对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、阴沟肠杆菌四种供试菌种最低抑菌浓度(MIC)均为0.5mg/mL,最小杀菌浓度(MBC)均为1mg/mL,对四种菌的杀菌作用强度顺序为:沙门氏菌=金黄色葡萄球菌>志贺氏菌>阴沟肠杆菌。超声波法提取所得桑葚籽总黄酮对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、阴沟肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)为1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、1mg/mL,最小杀菌浓度(MBC)为2mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL,对四种菌的杀菌作用强度顺序为:金黄色葡萄球菌>沙门氏菌>志贺氏菌>阴沟肠杆菌。对比可得,两种提取方式对金黄色葡萄球菌的杀菌作用强度相同,热回流法提取所得桑葚籽总黄酮对于沙门氏菌、志贺氏菌、阴沟肠杆菌的杀菌作用强于超声波法提取所得桑葚籽总黄酮,由此可见不同提取方式对桑葚籽总黄酮的抗菌性产生了一定的影响。
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