【摘 要】
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目的:探究microRNA-29a-3p在乳腺癌细胞系中的表达,明确miR-29a-3p对TRAF2、p70s6k/S6信号通路以及对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力影响的研究。方法:首先我们通过实时聚合酶链反应RT-PCR检测乳腺癌细胞系MCF-7、T47D、MDA-MB-231、BT-549、BT-474和正常乳腺细胞MCF-10A中miR-29a-3p的表达水平,选取了miR-29a-3p表达
【基金项目】
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国家自然科学基金（No.81572615）；
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目的:探究microRNA-29a-3p在乳腺癌细胞系中的表达,明确miR-29a-3p对TRAF2、p70s6k/S6信号通路以及对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力影响的研究。方法:首先我们通过实时聚合酶链反应RT-PCR检测乳腺癌细胞系MCF-7、T47D、MDA-MB-231、BT-549、BT-474和正常乳腺细胞MCF-10A中miR-29a-3p的表达水平,选取了miR-29a-3p表达较高的MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞进行后续实验。通过MTT实验、集落形成实验和transwell实验探究miR-29a-3p对MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭能力产生的影响,并且通过Western Blot法进一步检测ROCK、mmp2和p21蛋白的表达。随后我们在MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞系中分别转染miR-29a-3p mimic NC、miR-29a-3p mimic和miR-29a-3p inhibitor NC、miR-29a-3p inhibitor后,在保证转染效率的前提下,检测p70s6k/S6信号通路中关键蛋白的表达水平,并且在转染miR-29a-3p mimic的同时加入p70s6k的特异性抑制剂,检测磷酸化p70s6k和S6的表达水平。使用q RTPCR法和Western Blot法分别检测TRAF2 m RNA和蛋白的表达水平,运用数据库分析预测并且通过荧光素酶报告基因实验验证miR-29a-3p和TRAF2是否结合。最后在干扰TRAF2的同时转染miR-29a-3p mimic,Western Blot实验检测磷酸化p70s6k和S6的表达水平。结果:RT-PCR实验结果显示,与人正常乳腺细胞（MCF-10A）相比,miR-29a-3p在MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞和BT-549细胞等乳腺癌细胞系中的表达显著增加。Western Blot法检测相关功能学蛋白结果显示,转染miR-29a-3p mimic组的MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞的细胞增殖、迁移和侵袭能力显著提高,而转染miR-29a-3p inhibitor组的MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞的细胞增殖、迁移和侵袭能力显著降低。MTT法和集落形成实验结果进一步验证了转染miR-29a-3p mimic后促进其增殖,transwell实验结果进一步验证了转染miR-29a-3p mimic后提高了其迁移和侵袭能力,转染miR-29a-3p inhibitor组均出现相反的结果。此外,Western Blot实验结果显示,在MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞中转染miR-29a-3p mimic后,p70s6k和S6的磷酸化水平显著增加,p70s6k和S6的总蛋白水平无明显变化,而转染miR-29a-3p inhibitor后,磷酸化水平出现相反的趋势,总蛋白水平仍无明显变化;加入p70s6k的特异性抑制剂后,磷酸化S6的表达水平被显著抑制。另外,荧光素酶报告基因实验验证了miR-29a-3p可以与TRAF2相互结合,并且q RT-PCR实验和Western Blot实验结果证明,miR-29a-3p对TRAF2存在调控作用,miR-29a-3p与TRAF2的m RNA和蛋白水平的表达呈正相关。最后共转染siTRAF2和miR-29a-3p mimic后,显著逆转了si-TRAF2对磷酸化p70s6k和S6的下调作用。结论:综上,我们可以得出结论,miR-29a-3p通过结合并上调TRAF2激活p70s6k/S6信号通路促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。
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