肿瘤相关成纤维细胞与卵巢癌细胞顺铂耐药研究

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第一部分人上皮性卵巢癌相关成纤维细胞分离、纯化和培养目的:通过分离培养和鉴定人上皮性卵巢癌组织内的肿瘤相关成纤维细胞(CAFs),为研究CAFs在卵巢癌顺铂耐药中的作用及其可能机制提供实验基础。方法:收取人上皮性卵巢癌42例及正常卵巢上皮组织28例,分离培养原代CAFs和正常卵巢成纤维细胞(NFs);酶消化时间差法进行CAFs及NFs纯化;倒置相差显微镜下进行细胞形态的观察;间接免疫荧光法鉴定CAFs。结果:来自人上皮性卵巢癌新鲜组织中的CAFs被成功分离获得,CAFs在显微镜下呈长梭形,且阳性表达平滑肌激动蛋白-α(α-SMA)与成纤维细胞活化蛋白(FAP)。结论:成功分离纯化培养原代人上皮性卵巢癌CAFs。第二部分人上皮性卵巢癌相关成纤维细胞与卵巢癌细胞顺铂耐药的关系目的:研究卵巢癌相关成纤维细胞(CAFs)与卵巢癌细胞顺铂耐受的关系及其作用机制。方法:收集CAFs或NFs细胞培养上清与卵巢癌SKOV3细胞建立间接共培养体系;CCK8、划痕实验、流式细胞仪、ELISA法、实时定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)及免疫印迹法分别检测细胞共培养前后细胞增殖活性及顺铂对细胞的毒性、细胞迁移能力、细胞凋亡率、CAFs细胞上清液中OPN浓度、耐药相关基因YAP、CTGF和Cyr61在m RNA及蛋白水平表达。结果:CAFs及NFs分离纯化培养成功率分别为70%和60%;CAFs组的细胞增殖能力、顺铂半数抑制浓度(IC50)、迁移能力均较SKOV3组及NFs组显著增加(P<0.001、P<0.01、P<0.01);CAFs组顺铂所诱导细胞凋亡率较SKOV3组及NFs组明显降低(P<0.001);CAFs共培养后增加了癌细胞中耐药相关基因YAP、CTGF及Cyr61在m RNA及蛋白水平的表达量,差异具备统计学意义(P<0.01、P<0.05、P<0.01);CAFs组细胞上清液中OPN表达水平较SKOV3组及NFs组明显提升,且结果具有统计学意义(P<0.001)。结论:CAFs可加快SKOV3细胞的增殖及迁移,使SKOV3细胞抵抗凋亡,从而降低SKOV3细胞对顺铂敏感性。其作用机制可能与CAFs促进卵巢癌细胞中耐药基因YAP及其下游基因CTGF、Cyr61表达上调有关。
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